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酶的抑制剂与激活剂 授课教师: 余子全 研 究 生: 贾亮 何恋 一.目的与内容 目的：学习研究酶的抑制剂和激活剂的方法，并通过几种金属离子和表面活性剂对枯草杆菌碱性蛋白酶活力的影响，筛选出该酶的某些抑制剂和激活剂。 内容：1.几种金属离子Ca2+、Ag+、Cu2+、Hg2+和Mg2+对枯草杆菌碱性蛋白酶活力的影响；2.洗衣粉对枯草杆菌碱性蛋白酶活力的影响。 本实验所用的是枯草杆菌碱性蛋白酶，该酶是由地衣芽孢杆菌经深层发酵提炼所得，能将大分子蛋白质水解成游离的氨基酸等产物，最适pH值一般为9-11，最适温度为40-50℃。 Folin-酚法测碱性蛋白酶酶活原理 Folin-酚试剂在碱性条件下，其磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应(钼蓝和钨蓝的混合物)。 在一定浓度范围内，蓝色深浅与含酚羟基氨基酸 (酪氨酸)的量成正比，通过比较加入金属离子(或洗衣粉)后和未加入金属离子(或洗衣粉)的反应酶液的OD680值，可以推断出该种金属离子是该酶的激活剂还是抑制剂。 四.操作步骤 1．金属离子对酶活力的影响： (1)分别将1ml pH 10.0酶液与相应体积的氯化钙、硝酸银、硫酸铜、氯化汞、氯化镁溶液混合，使反应液中金属离子终浓度分别为0.8 mmol/L和0.4mmol/L。 (2)混合液及pH10原酶液、 pH10空白(共12支)25℃放置20 min。 (3)将混合液预热至40℃，加入预热的2%酪蛋白溶液1 ml，于40℃反应10 min。 (4)反应结束时加入10%三氯醋酸溶液2 ml(终止反应) ，立即摇匀，静置10 min。 (5)各取上清1.5ml于EP管中，6000rpm,离心1min 。取上清1ml于试管中，各加入0.4 mol/L Na2CO3溶液5ml及福林一酚试剂1 ml，置于40℃显色15 min 。 (6)测定OD680值 ，并以原酶活力为100，算出相对酶活。空白试验时，先加三氯醋酸溶液，再加入酶液和底物，同样测定OD680值。 4.在比色皿中装入的液体量大约是比色皿体积的三分之二。 六.实验报告 将实验结果填入下表中。 二.基本原理 酶分子与配体结合后，可以改变酶的活性。使酶活性降低乃至完全丧失活性的配体，称为酶的抑制剂；能启动和（或）增强酶的活性，称为酶的激活剂。研究酶的抑制和激活作用，具有重要的实用价值。 抑制剂或激活剂的作用部位，主要是酶的活性中心的必要基团或直接影响酶的结构残基所引起的效应。 三.器材和用具 1.恒温水浴锅，试管，722紫外可见分光光度计，移液枪，EP管，试管架。 2.试剂：20mM/L氯化钙， 20mM/L硝酸银， 20mM/L硫酸铜， 20mM/L氯化汞， 20mM/L氯化镁，0.6％洗衣粉， 0.4 mol/L 碳酸钠， 2％酪蛋白，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(稀释2000倍)，福林-酚(市售福林-酚试剂加水稀释1倍，约为1 mol/L )， 0.5M/L氢氧化钠，pH10硼砂缓冲液，pH7磷酸缓冲液， 10% TCA。 2．洗衣粉对酶活力的影响： (1)分别在pH 7.0和pH 10.0酶液中加入洗衣粉(反应液终浓度为0.03%)。 (2)混合液和pH7原酶液、 pH7空白(共4支)于25℃下放置20 min。 (3)测酶活力，并以原酶活力为100，算出相对酶活。 五.注意事项 1.实验中，以先加TCA的酶液为空白，以原酶液试管为 标准液，对其操作应与实验试管同步一致。 2.由于分光光度计比较精密，所以往试管中加药品的 时候要尽量做到准确。 3.拿比色皿是要拿它的毛面，不可以用手接触它的光滑 面；擦拭比色皿要顺着一个方向擦。