反相高效液相色谱法分离纯化野蚕黑卵蜂寄主识别利它素.docVIP

反相高效液相色谱法分离纯化野蚕黑卵蜂寄主识别利它素 【摘要】采用反相高效液相色谱和酶联免疫分析的方法进行了野蚕黑卵蜂寄主识别利它素分离和免疫活性测定。RPHPLC的分离条件是：C8反相色谱柱，在柱温30℃、流量1 mL/min的条件下，用0～2 min,100% A（5%乙腈+0.05%三氟乙酸）；2～6 min,100% A→100% B（95%乙腈+0.05%三氟乙酸）线性洗脱；6～8 min,100% B进行洗脱，DAD检测波长为280 nm。通过比较家蚕和野桑蚕色谱图发现，无论是粗提物还是上清液两者的峰形极其相似，有5个主要的馏分。通过粗提物和低温物理快速分离上清液的色谱图比较，确定了2号峰为低温物理快速法沉淀部分的馏分。收集家蚕的5种主要馏分，分别用利它素抗血清进行ELISA检测，证实2号峰是野蚕黑卵蜂寄主识别利它素，其免疫活性分别是上清液中其它馏分的100倍至1000倍。 【关键词】 野蚕黑卵蜂， 寄主识别利它素，反相高效液相色谱，酶联免疫分析 1 引言 从20世纪70年代开始，昆虫利它素的研究逐渐受到世界各国的高度重视 ［1~3］。利它素（kairomone）也称开洛蒙，是昆虫种间的一种它感化合物（allelochemicals），即由一种生物释放对另一种生物有利的化学物质。野蚕黑卵蜂(Telenomus theophilae)寄主识别利它素是控制寄生蜂产卵行为的信息化合物，对于研究昆虫的寄生行为和促进生物防治的发展具有重要的理论和实践意义。该利它素主要来源于家蚕(Bombyx mori）和野桑蚕（Theophila mandarina）雌蛾性附腺的粗提物中 ［4］。胡萃等 ［4～7］开展了对野蚕黑卵蜂的形态学、生物学、生态学、寄生行为及理化基础等方面的系统研究。高其康等 ［4］利用锡球假卵测定了蚕蛾的一些部位的利它素活性，最终确定其主要来源于野蚕黑卵蜂寄主野桑蚕和替代寄主家蚕雌蛾性附腺的分泌物中，并首次证实该利它素是分子量大于200 kDa的蛋白质。研究表明，野蚕黑卵蜂寄主识别利它素可以用低温物理法进行分离 ［4］。为了进一步深入研究野蚕黑卵蜂寄主识别利它素的组分构成及其分子结构，建立快速、有效的利它素色谱分离方法是进行生物质谱分析的关键之一。用反相高效色谱法分离蛋白质通常采用低离子强度酸性有机洗液和烷基硅胶键合固定相[8,9]，在低pH值的流动相、室温或较高的温度及使用乙腈或异丙醇作为流动相[9]的条件下进行。三氟乙酸（TFA）是蛋白质反相色谱的一种较好的流动相添加剂[10]。Witting等[11]指出，相对短链且不具有支链的键合固定相（如C4和C8烷基键合固定相）适合蛋白质的分离。本研究建立了从家蚕雌蛾性附腺粗提物中进行分离、纯化野蚕黑卵蜂寄主识别利它素的反相色谱分离方法，并对分离出的馏分进行酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）研究。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司）； C8反相色谱柱（PN：993967～906）；FC204馏分收集仪(法国GILSON公司)。Agilent 1100系列的G1315A型二极管阵列检测器（DAD）。乙腈（德国MERCK，HPLC级）；三氟乙酸（TFA）（Sigma，HPLC级）；实验用水经Millipore系统处理。ELISA试剂：TBS 500 mL；10 mmol/L TrisHCl(pH 7.5)；150 mmol/L NaCl；TBST 200 mL；TBS+0.05% Tween 20(V/V) (Sigma公司，分析纯)。封闭液：TBS+7.5%脱脂奶粉。显色液：TrisHCl(pH 9.5) 100 mmol/L，100 mmol/L NaCl，5 mmol/L MgCl2 ，BCIP/NBT（Promega公司，Cat.#S3771），所有试剂使用前均用0.22 mm的微孔滤膜过滤。家蚕茧（B. mori）为浙江大学蚕学系提供，品种为秋丰白玉；野桑蚕茧(T. mandarina)采自浙江省德清县。野蚕黑卵蜂寄主识别利它素的多克隆兔抗血清（10 mL）（浙江大学分析测试中心实验室提供）。 2.2 实验方法 2.2.1 色谱条件 柱温30℃、流量1 mL/min、上样量5 mu;L；首先用流动相A（5%乙腈+0.05%三氟乙酸）平衡分离柱，再用流动相B（95%乙腈+0.05%三氟乙酸）进行分离梯度程序洗脱，直至流动相基线稳定为止。经实验，选定DAD检测器参数为280 nm。在初步筛选利它素馏分的实验中，应用8 min分离程序较好：0～2 min,100% A；2～6 min,100%Ararr;100% B线性洗脱；6～8 min,100%