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大鼠胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定 【关键词】 胚胎 【摘要】 目的：探讨胚胎神经干细胞的分离、培养和鉴定方法。方法：原代培养、培养细胞生长状况观察、组织化学鉴定、流式细胞仪进行细胞凋亡分析。结果：准确分离出了神经干细胞，了解其生长规律及细胞凋亡的情况。结论：用此方法分离胚胎神经干细胞实用、便捷和可行。 【关键词】 大鼠;胚胎;神经干细胞 Extraction、Culture and Appraisal of the Rat Embryo Neural Stem Cells JI Shengpu,WEI Huiping Hebei North University，Zhangjiakou， 075000， China 【ABSTRACT】 Objective:To master extraction、culture and appraisal of the rat embryo neural stem cells initially by experiment,In this paper the growth rule and apoptosis of embryo neural stem cells were studied.Methods:the growth cycle and growth state for primary culture neural stem cells were observed carefully,and apoptosis was analyzed with histochemistry identitication and FCM(flow cytometry) as well.Results:investigated thororghly The neural stem cells were abstracted accurately, and their development cycle and apoptosis condition were investigated thoroughly.Conclusion:The result above can provide reliable evidence to obtain a great quantity of neural stem cells. 　 【KEY WORDS】 rat;embryo;neural stem cells 干细胞具有可再生为各种组织、器官的潜能，将其分离并使之向特定方向分化，就可以用健康组织代替病变组织，治疗心肌梗死、糖尿病等组织坏死性疾病、退行性病变、自体免疫性疾病等。神经干细胞（neural stem cells,NSCs）是具有增殖和分化潜能的原始神经细胞，它能分化成神经组织的各种细胞，如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等，并能自我更新，甚至能终身存在于神经系统之中。NSCs在理论和临床上都具有巨大的价值，我们知道，脑老化可能是神经系统退变性疾病的初级阶段，与疾病的发生有着相同的基础，目前已用NSCs治疗神经系统退变性疾病，并且也用于脑老化的治疗。为此我们需要大量的神经干细胞，本课题选取大鼠胚胎神经干细胞，探讨其分离、培养、鉴定的方法，并探讨其体外生长的生物学特性。 1 材料和方法 1.1 材料 培养基：小牛血清，天津生物制品研究所；DMEM/F12培养基；EGF、bFGF、辅助培养基等均购自北京试剂商店。实验动物：20d大鼠胚胎，由河北北方学院动物中心提供。 1.2 方法 原代培养 取材：在无菌室内取孕鼠新鲜子宫，用烧杯盛之，用75%酒精浸泡，严格无菌的条件下，取出胚胎，剪开头皮，撕去脑膜，掀开大脑皮层，分别取侧脑室部位和大脑皮层脑组织，用Hanks液反复冲洗，去掉血液和血块，除尽脑膜组织和结缔组织。分离细胞：将组织移入青霉素小瓶，剪碎脑组织，加入025%胰蛋白酶37℃度消化15min，然后加入含10%小牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，用200目不锈钢筛网过筛，获得单细胞悬液，然后离心，获细胞沉淀（1000转/min，8min）。细胞培养：在细胞沉淀内加入1ml含小牛血清的培养基，吹打均匀，制成细胞悬液。取出一滴细胞悬液，细胞计数板计数，然后以35万/ml细胞接种到25ml培养瓶中，37℃，5%二氧化碳，95%湿度孵箱培养。24h后除去贴壁的分化细胞和沉淀杂质。分为两组：一组加入含10%小牛血清的DMEM/F12培养基；另一组换为新鲜无血清胚胎神经干细胞培养基，其组分为：DMEM/F12，20ng/ml EGF,20ng/ml bFGF，辅助培养基。培养后视培养基颜色和细胞生长状况进行稀释和换液。 培养细胞生长状况观察 每天对细胞进行计数，随即选择10个高倍视野，取其平均值，