显微光学成像1.docVIP

荧光窜扰（Bleed-through）的来源以及控制 由荧光团发出波谱曲线的波带太宽且不对称导致。 可使发射光的波峰与激发光的波峰对应的波长有较大差别，以减小重叠区域的面积 如何对荧光显微镜进行优化 为使图像的亮度和分辨率必须最大化，首先要确保提供给样本足够强的光照，如汞灯和氙灯，其次要选用合适的滤光片使发射的荧光直接入射到目镜镜筒或摄像管。当两者同时采用时便可使荧光显微镜优化。还要保证物镜能够能够透过紫外线区域和可见光区域，荧光显微镜的各光学器件都要保证无损、无污、无油渍等污染物。 I是荧光分子数 以下为共聚焦显微镜部分： 原理小结: Confocal 利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像 。 共聚焦显微镜的结构特点 共聚焦显微镜主要有一个扫描单元、激光光源、物镜以及重构图像的软件组成。 1.点照明 2.具有照明pinhole和探测pinhole 3.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦), 共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面 4.具有扫描系统—— 逐点扫描成像 5.具有多个（四个） 荧光通道，可同时探测多个被标记物 44、氦氖激光与氩离子激光的常用波长 前者为633nm 后者为361nm、458nm, 476nm, 488nm, 514nm Ar激光器: 458nm, 476nm, 488nm, 514nm GreNe : 543nm; HeNe: 633nm Ar激光器(UV): 361nm 激光器的特点: 1) 方向性好: 激光基本延直线传播 2) 单色性好 :Dl=10-8nm 3) 高亮度: 激光方向性好, 其在空间上的能量分布是高度 集中的。 4) 偏振性: 激光为平面偏振光, 光纤耦合 45、激光危险的种类及激光防护 1、眼镜：大剂量激光照射导致角膜、视网膜的烧伤；长时间激光照射导致晶状体的不透明化 2、皮肤：烧伤或致癌（290-320nm） 3、化学危害：一些激光要求使用危险的或者有毒物质进行激发。如化学染料，激态复合物激光器。 4、电危害：大多数激光器用高电压 5、火灾隐患：化学染料激光器中用到的溶剂易燃，高电压或照明系统会导致燃烧。 46、共聚焦显微镜中的扫描方式及快速扫描的实现 扫描方式有3种：一种为stage scanning，一种为beaming scanning，还有一种为Nipkow扫描盘。 因为共聚焦成像是由一个个的像素组成，光栅扫描时每一帧需要约1秒。可采取措施使检流计驱动的棱镜达到共振频率，约10Khz，或者选用一个旋转的多边形透镜。这样的系统提高了全部帧的速率，但是也有一定的时间延迟； 另外一个提高扫描速度的办法是同时扫描几个隔开的点，如Nipkow扫描盘的扫描方法。每次扫描约20000个固定大小的孔，改系统的扫描频率达到1kHz. 共焦小孔为什么能够提高共聚焦显微镜的横向和纵向分辨率 空间滤波技术排除了焦点外的光以及样本的厚度超过聚焦平面时得到的强光。所有不是从聚焦平面得到的光速都被共??焦小孔滤掉了，从而形成高度精确地图像。 共聚焦显微镜在探测器前放置一个pinhole 小孔，用来阻止非焦面的信号，同时通过焦面的信号，以消除焦点模糊，正是因为pinhole小孔的存在，共聚焦显微镜具有了光切能力，能对厚样品进行三维层切成像。 共焦小孔大小与成像信噪比之间的关系 如果散粒噪声是共聚焦显微镜中检测到的唯一信号噪声，通过增加小孔大小可提高SNR，然而小孔过大时会得不到理想的共聚焦光学部分，小孔过小也会使信号下降率大于背景噪声的下降率，从而使SNR降低。因此，小孔的大小要求使SNR最大化，其大小由信号和背景的关系决定。 如何确定共聚焦小孔的最佳大小 要求使SNR最大化，其大小由信号和背景的关系决定。 共聚焦成像中Optical Units的定义 光单位是一个无量纲的量，表示离光轴的距离，用来度量点扩散光源的强度。不同的光学系统中选用optic units来表现成像的性质。