林业生物技术 知识课件6.基因工程酶学基础.pptVIP

1、核酸内切限制酶 1.4 连接方式 分子间的连接 不同的DNA片段通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来。 分子内的连接 由同一片段的两个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子。 AATTC……G G……CTTAA 5’ 5’ AATTC……G G……CTTAA 5’ 5’ AATTC……G G……CTTAA 5’ AATTC……G G……CTTAA 5’ T4连接酶 AMP+PPi ATP （a）分子间连接 （b）分子内连接 AATTC……G G……CTTAA 5’P P5’ (OH3’) (3’OH) GAATTC CTTAAG T4连接酶 AMP+PPi ATP 1.5 活性及影响因素 1、核酸内切限制酶 (1) 活性大小：酶对DNA水解程度不同。 (2) 酶的活性单位： 指1μg 纯的指定DNA在指定缓冲液中，于37℃（最适温度更准确）酶解1 h完全酶解DNA中所有同一限制性内切酶位点所需的酶量。 (3) 影响因素 ① DNA模板的纯度 ② DNA的甲基化程度 ③ 酶切反应温度 ④ DNA的分子结构 ⑤ 缓冲液 1、核酸内切限制酶 1、核酸内切限制酶 限制酶的星号活性（star activity）：即star活性或星星活性。是指在酶反应条件发生改变的情况下，该酶便失去了识别其固有的特异序列(识别位点)的能力，而会在新的识别位点上发生DNA分子的切割作用(即识别序列发生了改变)。 例如，正常的EcoRI其正常的识别序列是GAATTC，而EcoRI*的识别序列则是AATT。 核酸内切限制酶的星号活性 2、 DNA连接酶 2.1 定义及功能 裂口和缺口 裂口（Gap）：即DNA裂口，是指双链DNA分子上的某一条链失去一个或数个核苷酸时所出现的DNA单链断裂。 缺口（Nick）：即双链DNA分子的单链断裂，即在相邻的2个核苷酸分子之间，失去了(移走了)一个磷酸二酯链。 2、 DNA连接酶 DNA连接酶(DNA ligase)： 可使一段DNA 3`-OH末端和5`-P 末端形成3`,5`-磷酸二酯键，把两DNA片段连在一起封闭双链上形成的切口的酶。 利用ATP分子中的?-磷酸基团为能量，通过催化两条并排DNA链的5?-磷酸基团和3?-羟基之间，形成一个磷酸二酯键，而使两个DNA片段共价连接起来的特异的核酸酶。 2、 DNA连接酶 2.2 分类及作用机理 DNA连接酶：（大肠杆菌，NAD+提供能量） T4连接酶： ATP提供能量 DNA连接酶：粘性末端 T4连接酶：平末端和粘性末端 种类 连接作用 2、 DNA连接酶 2、 DNA连接酶 2.3 连接作用 A.粘性末端DNA片段的连接 ①同一限制酶切割位点连接 由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。当这样的两个DNA片段一起退火时，粘性末端单链间进行碱基配对，然后在DNA连接酶催化作用下形成共价结合的重组DNA分子。 ②不同限制酶切割位点连接 由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段，具有相同类型的粘性末端，即配对末端，也可以进行粘性不同末端连接。 2、 DNA连接酶 B.平末端片段的连接 ① T4 DNA连接酶连接法 T4 DNA连接酶与大肠杆菌DNA连接酶不同，它在具有ATP和高浓度酶的条件下，亦可以连接平末端的DNA片段。 ②同聚物加尾法 原理：本法的核心是利用末端核苷酸转移酶转移核苷酸的特殊功能。它能够将核苷酸加到DNA分子单链延伸末端的3?-OH基团上，而且不需要模板的存在。由于这种特性，所以当反应物中只存在一种脱氧核苷酸的条件下，便能够构成由同一种核苷酸组成的尾巴，在典型的情况下，这种同聚物尾巴可长达100个核苷酸左右。 用5?-末端特异的核酸外切酶 处理平末端DNA 从而形成具3?-末端延伸的 片段A和B 对片段A和B分别加入dATP和dTTP 以及共同的末端脱氧核苷酸转移酶 从而形成具poly(dA)和 poly(dT)的A片段和B片段 混合退火，通过poly(dA)和poly(dT) 之间的互补配对，形成重组体分子 转化E.coli， 并从中挑选重组体克隆 2、 DNA连接酶 ③衔接物连接法 在构建重组体DNA分子过程中，有的用平末端法或是同聚物加尾法，所形成的重组体分子是无法用原来的限制酶作特异性切割，因此无法重新获得插入的DNA片段。 衔接物(linker)定义 用化学法合成的一段由10～12个核苷酸组成的，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的寡核苷酸片段。 用化学法合成一段含BamHI 限制位点的六聚体衔接物分子 用T4 DNA连接酶将BamHI衔接物 连接到外源平