水产动物疾病学课件第6章(下)水产动物病原检测技术 知识.ppt

第六章(下) 水产动物病原的检测技术;免疫血清的制备;能作为免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。 兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。 (一).抗原与动物种属关系：差异越远越好； (二).动物的个体状况：适龄、健壮、正常、 体重合乎要求； (三).抗原的性质：不同动物种类对同一免疫原有不同的免疫应答； (四).按免疫血清用量和要求：选择不同物。;(一).免疫原的注射剂量 (二).免疫间隔时间：首次与二次尤为重要，整个免疫过程5至8次。 (三).免疫途径：免疫反应产生速度依次为静脉＞腹腔＞肌肉＞皮下＞皮内＞淋巴结＞足掌 ;1.颈动脉放血法：羊、兔最常用的方法 2.静脉采血法：羊、兔，小鼠断尾或眼球 3.心脏采血法：操作熟练如兔、豚鼠、鸡;(五) 抗血清的保存 1.4℃保存：可保存3～6个月 2.低温保存：-20～-40℃可保存2～3年 3.冰冻干燥保存：可保存3～5年;第一节 免疫学检测;一、免疫凝集试验 ;（一）直接凝集试验（direct agglutination）;A.无菌生理盐水 B.抗原(颗粒抗原) C.抗体;;;（二）间接凝集试验（indirect agglutination）;;（三）间接血凝试验（indirect hemagglutination） ;;;（四）协同凝集试验(Co-agglutination);;二、免疫沉淀试验 ;液相沉淀反应（fluid phase precipitation） 环状沉淀（ring precipitation） 絮状沉淀（flocculation） 免疫浊度测定（immuno-turbidimetry）。 凝胶扩散试验（gel diffusion） 单向琼脂扩散（single diffusion） 双向琼脂扩散（double diffusion） 凝胶免疫电泳（gel immunoelectrophoresis）;（一）环状沉淀试验;（二）絮状沉淀试验;（三）免疫浊度法;（四）免疫扩散(immunodiffusion);1、单向琼脂扩散 ;2、火箭电泳＝单向琼脂扩散＋电场;;3、双向琼脂扩散 ;　　 若在两孔内有两对或两对以上的抗原抗体系统，就能产生相应数量的分离的沉淀线。因此，利用此法可进行抗原或抗体的纯度分析。　　　 沉淀线形成的位置与抗原、抗体浓度有关，抗原浓度越浓，形成的沉淀线距离抗原孔越远，抗体浓度越浓，形成的沉淀线距抗体孔越远，因此，当固定抗体的浓度，稀释抗原，可根据已知浓度的抗原沉淀线的位置，测定未知抗原的浓度；反之, 可测定???体的效价。　　;;4、对流免疫电泳＝双向琼脂扩散＋电泳 ;;;三、与补体相关的试验;（一）溶解试验;1．溶血试验（hemolysis test） 红细胞（如绵羊红细胞）与相应抗体结合后，在有补体存在时，红细胞被溶解，称为溶血试验。参加反应的抗体称为溶血素。 2．被动溶血试验（passive hemolysis test） 红细胞吸附抗原后，在相应抗体和补体存在下，出现红细胞溶解反应，称之为被动溶血试验。本方法与直接溶血试验的主要区别在于红细胞与抗原孵育后，红细胞吸附了抗原而被致敏，其它与溶血试验相同。;3．溶菌试验（Bacteriolysis test） 革兰氏阴性菌在相应抗体和补体作用下，可引起菌体的溶解死亡，这与溶菌酶的溶菌反应有区别，故将由抗体和补体引起的溶菌反应称为免疫溶菌反应。实际上，这种免疫溶菌反应通常以细菌是否受到损伤、繁殖是否受到抑制、菌数（菌落）是否减少作为指标。有时将试管内的溶菌反应称为杀菌反应（bacteiocidal reaction）。 ;（二）补体结合试验（complement fixation test, CFT）;四、酶联免疫试验 ;;;;敏感性;（一）直接法 ;(二)间接法;;（三）双抗体夹心法 ;（四）竞争法 ;五、荧光免疫技术;;;;;;;;六、免疫电镜技术 ;（二）酶标记抗体法 在免疫电镜中，用于标记的酶主要有辣根过氧化物酶（HRP），因为其具有稳定性强、反应特异性高和分子量小、易于穿透组织和细胞等优点。组织标本经甲醛溶液固定后，漂洗去除甲醛溶液，再切成厚20μm的薄片，即可用酶标记抗体或其它间接染色法处理，反应显色后，按常规电镜脱水、包埋、切片、染色和观察。在电镜下，本法不如铁蛋白抗体法清晰。;（三）重金属标记抗体法 除铁蛋白抗体和酶标记抗体法外，还有重金属标记抗体法。由于在超微结构水平上研究抗原抗体反应的标记物如铁蛋白和HRP分子量较大，不是较理想的标记物，而醋酸铀的分子量较小，且铀原子具有电子致密性，能非特异性地结合在整个抗体分子上，故醋酸铀是一种较好的电镜标记物。用醋酸铀标记抗体时，必需先将抗原