重组人胰岛素及C 肽的分离纯化.pdfVIP

第 33 卷 第 5 期 北 京 化 工 大 学 学 报 Vol . 33 , No . 5 2006 年 J OU RNAL OF B EIJ IN G UN IV ERSI T Y OF CHEM ICAL TECHNOL O GY 2006 重组人胰岛素及 C 肽的分离纯化 冷 　雪 　陈劲春 　董 　鹏 (北京化工大学 生命科学与技术学院 , 北京 　100029) 摘 　要 : 对基因工程构建的含重组人胰岛素和 C 肽基因的毕赤酵母工程菌进行诱导表达 ,工程菌用甲醇诱导 72 h 后 ,离心去除菌体 ,上清液经中空纤维膜超滤后 SPSep harose Fast Flow 阳离子交换柱层析 ,0～400 mmol/ L NaCl 梯 度洗脱 ,得到纯度大于 92 %的重组人胰岛素原 。经 L ysC 酶和羧肽酶 B 酶切后 , Sep hadex G25 柱分离 ,得到了重 组人胰岛素和 C 肽 。 关键词 : 重组人胰岛素 ; C 肽 ; 毕赤酵母 ; 分离纯化 中图分类号 : Q786 　　胰岛素是治疗糖尿病的特效药物 ,含 5 1 个氨基 重组人胰岛素在 A 链的N 端和B 链的C 端 ,通过两 酸 , 由A 和 B 两条链构成 。C 肽是胰岛素 A 链和 B 个 L ys 连接 C 肽 ,B 链的 N 端连接有 6 个 His 构成 链之间的连接肽 , 为 3 1 个氨基酸序列的单链化合 的短肽[ 8 ] 来提高表达量 。经 10 L 发酵罐实验 , 目的 物 。含有 C 肽的胰岛素称为胰岛素原 ,酶解后 ,胰 蛋白产量可达 280 mg/ L 。纯化后的重组人胰岛素 岛素原裂解成为胰岛素和 C 肽 。在研究胰岛素的 原经 L ysC 酶和羧肽酶 B 酶切后 ,得到重组人胰岛 结构和生物功能的关系中 ,过去人们一直认为 C 肽 素和 C 肽 。 无生物活性 ,仅在胰岛素二硫键正确配对时起作用 , 1 　材料和方法 在 20 世纪 80 年代至 90 年代 ,科学家对不同长度的 C 肽进行了研究 ,发现 C 肽在胰岛素 A 、B 链正确配 11 　菌种 对时 ,可能只起柔性连接肽作用 。在很多重组胰岛 重组毕赤酵母基因工程菌由本实验室构建并保 素的研究中人们都重新设计 C 肽[ 13 ] 。但近年很多 存 。 研究肯定 C 肽具有多种生物学作用 ,用 C 肽对胰岛 12 　培养基 素依赖性病人进行替代治疗已有临床报道[4 ] ;在治 种子培养基( ) g 酵母提取物 ,2 g 大豆蛋 YP G :1 疗和预防糖尿病并发症方面 ,C 肽也具有很重要的 白胨 ,4 g 甘油溶于 100 mL 去离子水中;基础盐培养 作用[5 ] 。 基以及微量元素配方参照文献[ 9 ] 。 毕赤酵母表达系统在重组胰岛素的生产中已显 13 　试剂 示出了它的优越性 , 目前在国外已经展开了广泛的 中空纤维膜超滤装置购 自天津膜天膜公司; SP 研究和应用 ,但在国内还刚刚起步 。它具有表达稳 Sep haro se Fast Flow 和 Sep hadex G25 购 自Pharma 定 、易于高密度培养 、表达产物分泌到胞外和易于分 cia 公司 ;L ysC 酶和羧肽酶B 购 自Sigma 公司 ;其他 离等特点 ,广泛应用于外源蛋白的生产 。在用毕赤