基因与蛋白水平抑制b7cd28信号通路对狼疮样肾炎模型的逆转效应及分子机制分析-reverse effect and molecular mechanism analysis of gene and protein levels inhibiting b7cd 28 signal pathway on lupus nephritis model.docx

胞的阳性结合率分别为 89.2%、92.7%、20.6%及 48.5%；经 MTT 法分析，抗体能 够阻断 B7-1 介导的协同刺激信号，从而抑制 L929-B7-1 刺激 PBTCs 的增殖效应。 结论：成功制备了鼠抗人 B7-1 分子功能性单克隆抗体，体外研究结果显示，其 能够有效阻断 B7-1 介导的协同刺激信号。第三部分 小鼠狼疮样肾炎模型的建立及生物学鉴定目的：运用化学法建立小鼠（C57BL/6J）狼疮样肾炎模型，并对其进行生物 学鉴定。方法：6-8 周龄雌性 C57BL/6J 小鼠 30 只，随机分为造模组和正常对照组。 造模组予一次性腹腔注射 Pristane0.5ml/只，正常对照组予一次性腹腔注射生理盐 水 0.5ml/只。建模后第 10 天，每组处死 5 只小鼠，免疫荧光及流式细胞术( flow cytometry，FCM )分析脾脏中巨噬细胞（CD11b+）、树突状细胞（CD11c+）、粒细 胞（Gr1+）及 B 细胞（CD21+）的阳性表达率，同时检测 CD21+B 细胞膜型协同 刺激分子 CD86 及 MHC-II 分子的表达；每月定期活体眶经脉丛取血，检测血清中 ANA 及抗 dsDNA 抗体水平及采用 Albustix 试纸法检测尿蛋白量；持续观察至 8 个月时处死小鼠，HE 染色观察小鼠肾脏病理损伤，直接免疫荧光法分析肾脏免疫 复合物（IC）的沉积。结果：1.建模后第 10 天，脾脏中 Mφ、DC、粒细胞及 B 细 胞均出现不同程度的活化，其阳性表达率分别为 7.27±0.85%、4.72±0.68%、9.82±1.26%及 17.79±0.65%，与对照组相比明显升高，具有统计学差异（p0.05）； 同时，CD21+B 细胞膜型协同刺激分子 CD86 及 MHC-II 分子表达上调，分别为 38.69±3.14% 及 55.33±2.58%，与对照组具有统计学差异（p0.05）。2.动态观察至 3 个月时，造模组 30%小鼠血清 ANA 阳性，4 个月时达 80%，8 个月时 ANA 阳性 率为 100%；建模后 4 个月，20% 造模组小鼠可检测到抗 dsDNA 抗体，6 个月时 达 60%，8 个月时抗 dsDNA 抗体阳性率为 80%。3.经动态分析发现，建模后 4 个 月，20% 小鼠开始出现蛋白尿，尿蛋白含量为 +～++（300～1000mg/L），随着时 间的推移，蛋白尿的阳性率和尿蛋白含量逐渐增加，8 个月时 100% 小鼠出现蛋白 尿，含量为 ++～++++（1000～20000mg/L）。4.肾脏冰冻切片直接免疫荧光法分 析显示，造模组小鼠肾小球出现强阳性的 IC 沉积。5.肾脏组织病理学分析显示， 造模组肾小球体积增大，细胞数量增多，肾小球血管充血明显，间质明显淋巴细胞浸润。结论：Pristane 诱导的小鼠狼疮样肾炎模型作为研究人类 SLE 的疾病模型 具有可靠性。第四部分 基因与蛋白水平抑制 B7/CD28 信号通路对狼疮样肾炎 模型的逆转效应及分子机制研究目的：运用 B7-1shRNA 慢病毒载体及 B7-1 单克隆抗体分别在基因与蛋白水 平抑制 B7/CD28 信号通路，比较不同水平的干预，对狼疮样肾炎模型的形成及病 理损伤的逆转效应及其分子机制，同时考察特异性抗体对该类疾病的治疗作用。 方法：1.实验动物的分组处理：6-8 周龄雌性 C57BL/6J 小鼠随机分为 8 组。A： 正常对照组，一次性腹腔注射生理盐水 0.5ml/只；B：造模组，一次性腹腔注射 Pristane 0.5ml/只；C：B7-1 抗体早期干预组，腹腔注射 Pristane 0.5ml/只后，第 1、 3、5、8 及 15 天分别尾静脉注射 B7-1 单抗 200μg/只，然后每隔 1 个月注射一次， 连续注射 3 个月；D：抗体同型对照组，注射等剂量的小鼠 IgG1；E：慢病毒干扰 组，腹腔注射 Pristane 0.5ml/只后，第 1、60 天分别尾静脉注射 0.4x108TU 的 LV-B7-1shRNA；F：慢病毒空载组，腹腔注射 Pristane 0.5ml/只后，第 1、60 天分 别尾静脉注射 LV-NCshRNA；G：化学药物阳性对照（CTX）组，腹腔注射 Pristane 0.5ml/只后，第 1、8、22、29、43、50、64、71、85、92 天分别尾静脉注射 CTX0.5ml（60mg/kg/次）；H：B7-1 抗体延迟干预（治疗）组，腹腔注射 Pristane 0.5ml/ 只后第 4 个月，待出现蛋白尿及自身抗体时运用 B7-1 抗体，注射次数及剂量同 C 组。2.B7-1shRNA 慢病毒感染后对脾脏 APC 膜型 B7-1 分子表达的干预效