脊髓背根神经节cebpβ在神经病理性疼痛 中调控作用的研究-study on the regulatory role of cebp β in neuropathic pain in dorsal root ganglion of spinal cord.docx

原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究 所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：日期：年月日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。 根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门 或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学 可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或者其他复印手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文 或与该学位论文直接有关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：日期：年月日脊髓背根神经节 C/EBPβ在神经病理性疼痛中调控作用的 研究研究生：毛元元 导师：张卫郑州大学第一附属医院麻醉科 中国 郑州 450052摘要研究背景神经病理性疼痛的治疗是一项世界性难题。传统的药物治疗仅能缓解部分 症状，且长期使用可能出现严重的副作用。有关神经病理性疼痛机制的研究对 于新的治疗方案的提出有重要意义。表观遗传调控在神经病理性疼痛中的作用 越来越明显。组蛋白的修饰作为表观遗传学的重要组成部分，参与神经病理性 疼痛的调控。研究发现组蛋白甲基转移酶 G9a 通过调控 μ 阿片受体（Mu opioid receptor, MOR）和钾离子通道 Kv1.2 在神经病理性疼痛中发挥关键作用。转录因 子 CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP)β 可以激活 G9a 基因表达参与脂质的 形成。但在神经系统中 C/EBPβ 是否参与 G9a 的调控以及 C/EBPβ 在神经病理性 疼痛中具体作用，目前还不清楚。研究目的探讨 C/EBPβ 是否参与神经病理性疼痛的调控及其作用机制。研究方法通过坐骨神经慢性压迫性损伤（Chronic construction injury，CCI）手术制作 神经病理性疼痛的动物模型，观察神经病理性疼痛中 C/EBPβ 表达情况。I通过 siRNA 基因沉默和脊髓背根神经节（Dorsal root ganglia，DRG）显微注射方法下调 C/EBPβ 的表达，观察动物机械缩足阈值、热缩足潜伏期、冷缩 足潜伏期以及运动功能的变化。3. 通过 AAV 载体和 DRG 显微注射技术上调 C/EBPβ 的表达，观察动物机械缩 足阈值、热缩足潜伏期、冷缩足潜伏期和运动功能的变化以及是否产生条件 位置偏爱现象。利用 RT-PCR 和 Western Blot 方法，检测抑制或过表达 C/EBPβ 后 DRG 内 G9a、 MOR 和 Kv1.2 的 mRNA 和蛋白含量的变化；通过免疫组织化学和单细胞 RT-PCR 技术检测 C/EBPβ 与 G9a、MOR 和 Kv1.2 的共表达情况；通过染色 质免疫共沉淀技术检验 DRG 内 C/EBPβ 与 G9a 的直接作用；采用基因敲除、 细胞培养等技术探讨 G9a 在 C/EBPβ 调控通路中的作用。结果1. CCI 引起外周神经损伤后，受损 DRG 内 C/EBPβ 的表达在术后 3 天即升高， 一直持续至术后 14 天。2. DRG 内预先注射 C/EBPβ siRNA 能够阻止 CCI 诱导动物产生神经病理性疼痛 的症状。CCI 术后采用 siRNA 的方法降低 C/EBPβ 的表达能够缓解动物神经 损伤引起的痛敏症状。3. DRG 内升高 C/EBPβ 的表达能够诱导动物产生对机械刺激和温度刺激的痛觉 过敏以及自发性疼痛的症状。4. 无论 siRNA 基因沉默、AAV 载体过表达还是 DRG 显微注射技术均不影响动 物的运动功能。CCI 能够引起受损 DRG 内 C/EBPβ 和 G9a 的蛋白与 mRNA 含量升高，MOR 和 Kv1.2 的蛋白与 mRNA 水平下降。抑制 C/EBPβ 的表达能够下调 CCI 引起 的 G9a 的高表达同时升高 MOR 和 Kv1.2 的表达。模拟神经病理性疼痛中 DRG 内 C/EBPβ 的高表达能够上调 DRG 内 G9a 的表达并降低 MOR 和 Kv1.2 的蛋 白和 mRNA 水平。6. 神经损伤能够促使受损 DRG 内 C/EBPβ 与 G9a 基因的结合增加。而且 C/EBPβ能够与 G9a、MOR 及 Kv1.2 共表达于 DRG 细胞中。7. DRG 内基因敲除 G9a 可以阻止 C/EBPβ 对 MOR 和 Kv1.2 的调控作用。II结论DRG 内 C/EBPβ通过调