家蚕第二隐性赤蚁基因ch2的图位克隆-mapping clone of silkworm second recessive red ant gene ch2.docxVIP

摘要着色是动物最具多样化的特征之一，体色艳丽，形状奇特的蝴蝶和部分蛾类，具有很高的观赏价值。体色的研究对探讨昆虫遗传多态性、适应机制及生物进化等具有重要的意义。家蚕的色彩突变涉及家蚕的各个生长时期，胚胎期，幼虫期、蛹期、成虫期，包括蚕茧也具有丰富的颜色变化。不同的基因变异导致控制家蚕体内的各种黑色素、蝶啶、眼黄素等在表皮细胞和真皮细胞中的积累和相互作用，可以形成不同体色突变。目前已发现100多种突变都与着色模式异常相关，因此，研究家蚕体色形成机制，有助于为色素模式的遗传学基础研究提供丰富资源，使人们深层次认识色素功能，同时为家蚕品种资源的多样性分析提供了依据。第二隐性赤蚁基因(ch-2)是少数只在蚁蚕时期显现出可辨别表型的体色突变型之一，作为标志性基因，本研究利用SSR、STS和CAPs分子标记技术和siRNA干扰技术，对其进行图位克隆和功能补偿验证，其主要内容及结果如下：1.对ch-2基因的初步定位和连锁分析供试家蚕品种正常黑蚁P50和突变体赤蚁ch-2品种k04均由中国农业科学院蚕业研究所提供。用k04和P50作为亲本组建F1代及BC1回交群体(k04×p50)×k04和k04×(k04×P50)，分别记作BC1F和BC1M。基于雌性家蚕的W与Z染色体不发生交换的特点，采用此两种回交群体通过已经构建的家蚕SSR分子标记连锁图谱用BC1F群体进行连锁分析，用BC1M群体构建遗传连锁图，寻找与ch-2基因连锁的标记，结果显示在第18连锁群上发现7个多态SSR标记(S1804、S1807、S1808、S1809、S1812、S1814andS1819)，重新设计微卫星位点的引物，结果在S1804和S1807附近找到2个新的多态SSR标记ZR1807和ZR1817，这9个标记在BC1F群中的电泳谱中所有黑色个体均表现出与F1相同的杂合带型；而所有赤蚁带型与k04一致，为纯合型；用BC1M群体采用作图软件Mapmaker3.0，根据整个数据阵计算重组值（LOD取5.0），绘制出ch-2基因的分子连锁图。绘制的遗传连锁图的遗传距离为70.7cM，ch-2基因位于中间69.6cM处，S1814和S1819与ch-2基因距离最近，与ch-2基因的距离分别是7.9cM和1.1cM。2对第二隐性赤蚁基因ch-2的精细定位及ch-2基因全长的获得经与家蚕基因组数据库进行比对，S1814位于家蚕基因组精细图的nscaf2902的1.526Mb处，而S1819不能在基因组精细图中比对到序列，说明S1819的序列位于已知的家蚕基因组精细图中的scaffold外部，这与其位于遗传连锁图的尾端是符合的，说明S1819所在区域的序列还没有能够被测通或者没有能够被正确拼装。于是我们在nscaf2902和nscaf2901上用Primer.primer5.0设计更多的STS和CAPS引物的标记，通过测序酶切PCR产物将ch-2锁定在300kb以内的区域，通过Blast程序搜索，经同源序列比对，发现预测基因BGIBMGA008245-TA表皮蛋白（CPG6）基因和BGIBMGA008268-TA基因，可能与着色相关。查询数据库，并了解该基因的功能，将目标锁定为BGIBMGA008245-TA表皮蛋白（CPG6）基因。通过对P50表皮进行5’和3’RACE-cDNA扩增，利用DNAMAN拼接得到了ch-2基因的全长。3．候选基因功能验证用家蚕品种正常黑蚁P50和突变体赤蚁ch-2品种k04的不同催青天数的蚕卵，液氮速冻后提取RNA，反转录为cDNA后进行普通PCR扩增，凝胶回收PCR产物，克隆测序，比较亲本间的序列差异。结果发现表皮蛋白(CPG6)的表达在催青第一天和第四天均无差异，而第九天在突变体中存在156bp左右的缺失表达，根据表皮蛋白(CPG6)在突变体中的表达差异性，对差异序列进行SiRNA设计，注射到经过不同时间催青处理的蚕卵中进行催青，并对孵化的卵数进行统计，对未孵化的卵进行解剖，发现了赤色的蚁蚕。关键词家蚕，SSR，第二隐性赤蚁基因，基因定位，候选基因，功能验证AbstractColorationisoneofthevariegatedcharacteristicsforinsects.ItisquiteavaluetoviewandadmireforradiantlybeautifμLandoddbutterfliesandsomemoth.itisinterestingandimpotanttoexplorethegeneticpolymorphisms,adaptivemechanismandbiologicalevolutionforinsects.Colourmutationareinvolvedinvariousgrowthperiod