家蚕受体酪氨酸激酶样的孤独受体ror2基因功能的分析-analysis of the function of ror 2 gene of silkworm receptor tyrosine kinase - like loneliness receptor.docx

从总体趋势来说，BmRor2基因在各组织的表达量均不太高。BmRor2在卵巢组织和精巢组织均为在四龄第4天的表达量最高，而其他时期的表达量均比较低。为了探讨BmRor2的表达规律及细胞定位特征制备了BmRor2蛋白的抗体。五龄第3天家蚕主要组织的Westernblotting检测结果显示，在头中可以检测到BmRor2蛋白。免疫荧光显示，BmRor2在卵巢来源的BmN细胞中能够表达，且主要分布在细胞膜周围，与其具有受体功能相一致。四龄第四天的家蚕主要组织免疫组化结果显示，BmRor2蛋白在各组织均有表达，且头部表达量最高，与Real-TimePCR、Westernblotting结果一致。3转基因通用载体pBGRN的构建为了更高效、更方便的筛选到转基因家蚕，构建了转基因通用载体pBGRN。该载体以piggyBac转座子元件为基本骨架，并克隆了neo、dsRed、和EGFP基因表达元件，其中neo基因由BmNPV来源的启动子ie-1驱动，使转基因家蚕获得G418抗性，在初期可用G418对转基因家蚕进行筛选；dsRed由人工启动子3×P3控制，可使转基因家蚕的红色眼具有红色荧光，可以在胚胎期、蛹期和蛾期进行观察筛选。EGFP使用ie-1来启动，使转基因家蚕具有绿色荧光，可以在孵化前和蛹期进行观察筛选。因此构建的转基因通用载体含有多重筛选基因，可以更方便高效的筛选得到转基因家蚕。4调节BmRor2基因的表达量对细胞大小和周期的影响为了探讨构建的转基因通用载体pBGRN的实用性，构建了过表达家蚕Ror2基因的重组载体PBGRN-Ror2。该载体转染家蚕卵巢细胞，48h后就能观察到绿色荧光细胞，进一步通过G418连续筛选获得了过表达家蚕Ror2基因的转化细胞系。通过定量PCR检测BmRor2基因的表达水平，发现其上调5.14倍。说明所构建的转基因通用载体pBGRN可以使用，而且可以方便地获取转化家蚕细胞系。为了探讨Ror2基因的功能，通过定量PCR研究了过表达Ror2基因以及下调Ror2基因对家蚕部分信号通路中一些关键基因表达水平的影响。结果显示，过表达BmRor2基因后，wnt、socs6、stat、pr基因没有明显的变化，socs2基因的表达量较BmN细胞上调1.56倍，crb、wts、cat、fj、dpp、kibra、serr、myc基因的表达量较BmN细胞都发生了下调。下调Ror2基因后，dpp基因上调了1.88倍，stat、socs2、socs6基因没有明显变化，crb、wts、cat、fj、kibra、myc也发生了下调。并且过表达Ror2基因的BmN细胞体积有所减小，增殖速度变慢。说明家蚕的Ror2基因对细胞大小有调节作用。关键词：家蚕；BmRor2基因；表达模式；转基因载体；过表达贡成良作者：刘伟指导教师：曹广力ThefunctionoftheReceptorTyrosineKinase-likeOrphanReceptor2GeneRor2inSilkworm,BombyxmoriAbstractThereceptortyrosinekinase-likeorphanreceptorRor2isamemberofthereceptortyrosinekinaseorphanreceptor(ROR)family,whichbelongstothereceptortyrosinekinase(RTK)superfamily.Itisasingle-transmembranereceptor,onlyatyrosinekinasedomain.RTKsarealargefamilyofglycoproteinsthatregulatecellproliferation,polarity,differentiation,migration,metabolismandsurvival.Inmammalianlikemouse,Ror2mutantmouseshowrespiratorydysfunctionandleadtoneonatallethality.Xror2anditsmutantalsoinhibitconvergentextension.SoRor2mayplayimportantrolesinearlydevelopmentstages.Ror2isahighlyconservedreceptortyrosinekinasewithhomologsinmanymetazoansfromAplysiatoDrosophilatohumans.ThesilkwormisthetypespeciesofLepidopteraandtheresearchreportsofgenesandmolecularmechani