家蚕类浓核病毒的细胞病理学研究及家蚕胚胎细胞系swau1-bme的建立-cytopathology study of bombyx mori concentrated nuclear virus and establishment of silkworm embryo cell line swau 1 - bme.docx

中艾摘理「一一一←一十二-一二一一一一一一一一...中文摘要家蚕浓核病毒〈中囡株〉引起的家蚕浓核病是我国蚕业生产上的重要病害，严重影响蚕丝的产量和质量，削弱了国际竞争力.家蚕类浓核病毒(DNV-like)是一株从西南农业大学家蚕基因库分离到的家蚕类浓核病毒.本论文对其病原性和病理学进行了研究，并对宫的分子生物学特性进行了初步研究。1.病原性研究z用不同浓度梯度的DNV-like和BmDNV-2，分别对不同品种的家蚕攻毒，逐日统计累计死亡率.结果表明tDNV-like属于慢性致死性病毒，从接种的第12夭开始死亡.在病原性上与BmDNV-2有一定的差异:DNV-like的致病力远大于BmDNV-2:而且它们对不同家蚕品种的敏感性也不一样.2.病理学研究z常规HE染色和组织荧光原性杂交显示，家蚕感染该病毒以后，首先寄生在家蚕中局的跚筒形细胞，并表现为核的极度膨大并破裂，最大核为正常核的3倍以上:荧光原位杂交结果表明，该病毒在圆筒形细胞核内增殖，随着感染加深，邻近的杯形细胞也会受到感撩.从这一点上看.与BmDN飞人2类似。但蚕体其它组织也表现出.阳性信号，比如指肪体、肌纤维.这与BmDNV-2在感染部位上有一定的差异.病蚕中炀组织超微切片也显示出该病毒首先在核内增生.然后核仁发生病变，产生病毒发生基质，继而形成病毒粒子并广泛分布于细胞核中。3.病毒DNA的研究:对DNV-like抽提的DNA进行电泳，发现只有一条大约6.5胁的带。明显不同于BmDNV-2的两条带(6.6kb和6.1kb)，也大于BmDNV-J的一条带(5.0kb)0综合以上因素，可以极步认为该病毒是一种新型家釜浓核病毒，但要对它准确分类，还需要很多数据，故暂命名为D阳Iikeo昆虫细胞培养是是伴随着昆虫病毒研究而发展起来的，同时也是动物细胞培养工程中的一个重要方面，广泛应用于医学、农业及生物学的各个领域.为了满足学科研究和发展的多方面需要，人们还在不断毅力于新的昆虫细胞系的建立.因此，建立和筛选有效支持病毒增殖和外源基因离水平表达的昆虫细胞系受到了特别关注.为了进一步研究DNV-like以及其它家蚕病毒的致病机理，建立高效的病毒离体复制系统，更为了向细胞工程研究提供理想的材料，本研究还尝试建立高繁殖力、对病毒敏感的家蚕细胞系.对多个品种家蚕的中晚期胚胎使用膜酶半消化法建立原代初级培养，在长达11个月的分化、淘汰及筛选过程中，先后出现了多种组织，其中以网状组织、管状组织、黯肪体组织以及报瘤状组织为主.其中以杂交种的活力最大，组织更替快，生长也比较快.最后从杂交种得到的根瘤状组织中获得了高繁殖力的细胞群体，这时细胞种类复杂，繁殖力也不稳定.经过3个月的继续筛选，获得了繁殖力稳定、细胞形态比校均一的细胞系.命名为两农蚕胚1号细胞系，英文名Sou伽westAgriculturalUniversityBombyxmor;.L1，筒写为SWAUI-BmE。该细胞系以梭形和近圆形细胞为主，杂以少量多突起和巨型细胞.细胞系的倍增时间在2St;时为57.6小时，染鱼体呈短轩状或颗控状，弥散型着丝粒，染色体数目异倍化，具有典型鳞翅目昆虫细胞系染色体特征.本细胞系对同源的多角体病毒BmNPV特别敏感，远远大于本研究室现保存细跑系，是研究家蚕杆状病毒及其表达载体的理想材料.词:东蚕.蚕类浓核病毒病原位组织病理学应蛤细胞系IlABSTRACTABSTRACTGreat1创smM钝ricuJtnrehavebeeDcausedbys监W回mdisease，amongwhich.，Bom句EXmovtdensovirus(BmDNV)isoneofthema画caus臼.DNV-likeisaDNVstrainfromsilkwonngenebankofSouthwestAgricuhuralU回venity.Inorder抽出缸部terizethepro阳tiesof也isvirusand伊event也ebreakoutofsilkw创mdise割e，studiesoni:岳阳也ogen:弘pathologyandnucleicacidhavebeenmade.The筑udyonDNV-Likes归由ogenyinsilkw倒四1hadbeendonebydealingwithdiffer回tconcentrationsolutionofBmDNV-2andDN弘likerespectìvely.Theresultsdemonstrated由atDNV唰Likespa曲。genyw因similartoBmDNV-2.But也evirulenceofDNV-likew出muchhigber由扭曲atofBmDNV-2，副lddi宵町entvarietiesofsilkwollDhaddiffere