建立rdpcr技术的体内方法分析环境致癌物对p53基因的dna损伤-to establish an in vivo method of rd pcr to analyze the dna damage of p53 gene caused by environmental carcinogens..docxVIP

建立RDPCR技术的体内方法研究环境孜癌物对p53基因的DNA损伤(捷要〉研究生t熊开容导师:衡正昌教授B陆损伤是环境致癌过程中早骂骂可检测的关键步骤，王军检泌具有重要的毒理学意义。我室建立的依赖随机化末端连接物PC在(RandomizedterminallinkerdependentPCR，RDPCR)技术即可检测特定基因的DJA损伤。本室运用该技术已取得了一些重耍的研究结果。RDPCR是在Pfeifer等建立的连接介导聚合酶链反应(Ligation-mediatedpolymerasechainreacUOZI费LMPCR)及其系列技术的基础上建立的。这一系列方法部注重子方法学的探讨，部此主要涉及的是体外实验的研究。为了拓展这一前沿技术在毒理学研究领域的应用，必须建立其相应的体内方法。本研究在另行设计基因特异性引物的主基础上，建立RDPCR技术的体内方法:并应用RDPCR技术体内方法检泌置在络酸部及联苯胶对大鼠p53墓园外显子7的D陆损伤.!éJ注首次将RDPC茸技术应用于LMPCR及其系列方法少有涉足的体内实验的研究，更为确切地评定某些环境致癌物对特定基因的DNA损伤作用:分析染毒物质的损伤热点与所致肿瘤的突变热点的关系，探讨致突变/致癌的分子梳理。第一部分引辖设计及她高辛辑记嚣针的制备LMPCR及其相关技术传统使用的放射性标记和自显影技术存在种种不便，本研究沿用本案建立的地高辛标记的非放射性显色技术。我们以提取的大鼠肝组织基因组DNA为模板，成功的应mPCR技术扩增了187峙的p53基因外显子7:通过对影响凝胶回收因素的有效控制，大大提高了p53基因外孩子7扩增产物的琼脂糖电泳纯化的回收率:以纯化的p53基因外显子7为模板，用PC茸法送行士远离亭的李放射性标记α辛苦脂糖电泳可见泳动速度稍↑曼的PCR法标记探针条带。第二部分RDPCR技术体内方法的建立夜本部分的研究中，我们以重续费量铸染辛辛大鼠并提取脐组织基因组DNA.用基因特异性引物1延伸至基因组DNA受损的碱基位点，形成一系列的单链扩增产物，这些产物E宽z接与双链的具有3(也Linkeωe川r〉在T4D阳N战连接酶作用下连在接，然后用基因特异性引物2(锚寇在引物1上〉和连接物弓i物(Linker的上链〉经PCR放大。PCR产物电泳后转Ep到尼龙膜上，然后与第一部分制备的地离辛探针杂交后显色n结果显示，在20.0mg/kg和40.0mg/kg剂量下，出现了两条清晰的杂交带，表现窒络酸御ílJ引起大鼠姊p53基因外显子?的DNA损伤，应有两个损伤位点。这与RDPCR体外实验的结果较一致，说明我们成功地建立了RDPCR技术的体内方法。第三部分阳PCR技术体内万法检泪IJDNA损伤的应用本部分我们进行阳PCR技术体内方法的应用研究。研究发现大鼠经联苯胶染毒后，主主济组织基因组DNA经RDPCR扩增后，再经探针杂交显色，可在尼龙膜上出现若干的特异的杂交条错。由此说明联苯按可能在大鼠济组织内形成了加合物并惚碍了古以聚合辈革的合成，p53基因外显子7经RDPCR扩增后产生了若干受阻的DNA断片。这为阎明联苯践诱发移就癌的分子机理提供了有益的依据，同时进一步还确了RDPCR体内方法的可行性。关键诩:DNA损伤体内p53基翻地离辛标记探针RDPCR2EstablishRDPCRinvivotodetecttheDNAdamageofp53geneinducedbyenvironmentalcarcinogen(Abstract)Postgraduate:X?ongKairongTutor:Pro.HengZhengchangDNAdamageisadetectablekeystepduringtheenvironmentalcarcinogenesisanditsdetectionhasveryimportanttoxicologicalsignificance.Therandomizedterrninallinker-DependentPCR(RDPCR)，thenewlyinnovatedmethodbyourlaboratory，candet.ectDNAdamage.Sornei酷portantresultshavebeenobtainedbyuseofRDPCR.RDPCRisestablishedonthebaseoftheligation-mediatedpolymerasechainreaction(1必PCR)始chniquewhichisestablishedbyPfeiferetal.Forthesakeofdiscussingthemethodology，theyalmostpayalltheirattentiontotheresearchinvitro.1n