蛋白质的分离与 及鉴定基因与 及蛋白质工程课件.pptVIP

3. Bradford法的缺点 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 γ—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1M的NaOH，少量的去污剂可通过用适当的对照消除，而必要时必须预先处理样品。 标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。 4. 注意事项 如果要求严格，最好在试剂加入后的5~20min内测定光吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。 测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。 若选择在旋涡混合器上混合，注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除。 蛋白质质谱分析与鉴定 一、质谱的概念 质量是物质的固有特征之一，不同的物质有不同的质量谱——质谱 质谱技术的基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子间的荷质比(m/e)的差异分离并确定分子量。一个完整的质谱分析系统由离子源，质量分析器和检测器3个部分组成，再辅以进样系统和后续分析系统 。 MALDI-TOF-MS 蛋白质组分析仪 傅立叶离子回旋变换质谱 付立叶变换回旋共振质谱仪 二、质谱类型 质谱有多种离子化的方法，就蛋白质组学而言，基质辅助的激光解吸附离子化 (matrix-assisted laser desorption ionization，MALDI)和电喷雾离子化(electrospray ionization，ESI)是二种最主要的类型。这两种类型离子化使得在fmol(10-15)乃至attomole (10-18 )水平检测分子量高达几十万的生物大分子成为可能 。 在蛋白质组学中，目前最为常用的质谱分析系统包括以单一质谱为基础的和以串联质谱为基础的两大类： 以单一质谱为基础的质谱分析系统以MALDI-TOF MS为代表。 串联质谱以ESI-MS MS为代表， 三、MALDI-TOF质谱 基质辅助的激光解吸附离子化 （MALDI）的电离方式在1988年由Karas和Hillenkamp提出。 仪器主要由两部分组成：基质附助激光解吸电离离子源（MALDI）和飞行时间质量分析器（TOF, time-of-flight )。 1. MALDI的原理 MALDI的工作原理是用小分子有机物作基质，将样品溶液和基质混合均匀，干燥成为晶体或半晶体后送入离子源内。用一定波长的脉冲式激光照射，基质分子能有效地吸收激光能量，瞬间由固态转化为气态，基质离子与样品相互碰撞使样品离子化，而得以进行质谱分析。常用的基质分子有2,5-二羟基苯甲酸、芥子酸、烟酸、2-氰基,4-羟基肉桂酸等。 2. TOF的原理 TOF是离子源中每一脉冲激光产生的离子先经过一个加速电场，获得动能，再进入一个高真空无电场飞行管道，离子在此无场飞行管道内以在加速电场获得的速度飞行。质量较轻的离子飞行速度快，较早到达检测器，较重的离子飞行速度慢，较晚到达检测器，离子的飞行时间与其质荷比的平方根(m/z)1/2成正比，通过检测飞行时间来测定离子的质荷比，此即为TOF. 3. MALDI的优缺点 优点：1）MALDI-TOF是一种软电离技术，准分子离子峰很强，不产生或产生较少的碎片离子。2）它可直接应用于混合物的分析，也可用来检测样品中是否含有杂质及杂质的分子量。3）MALDI-TOF的准确度高达0.1%~0.01%，远远高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术；4）能直接测定难于电离的样品，特别是生物大分子物质如多肽、核酸、蛋白等.目前可测定生物大分子的分子量高达600KDa。 缺点：1）该方法不合适用于肽序列分析。2）样品的质量对其影响很大，如变性剂、缓冲液盐、金属或有机修饰物（DTT、尿素、甘油等）会抑制离子源的肽电离。 金黄色葡萄球菌甲氧苯青霉素敏感株 (A)和耐药株(B)的典型质谱图 血液制品人血清白蛋白的 MALDI/MS质谱图 溶菌酶 的 MALDI／MS质谱图 图中3号峰质量数为14373，它是溶菌酶的质子化分子离子峰[M+H]+ ，按此推算溶菌酶的相对分子质量应为14372。2号峰为溶菌酶分子的双电荷[M+2H]2+ 峰; 4、5、6、7号峰分别对应于二聚体[2M+H]+、三聚体[3M+H]+、四聚体[4M+H]+和五聚体[5M+H]