hiv核酸检测技术 知识2014 .pptVIP

* * 关于不同HIV定量检测方法的选择 目前用于统一不同定量方法检测值的标准品还没有问世 不同定量方法结果之间还无法直接比较 同一病人治疗前后建议用同一方法进行HIV定量检测 * * 提高敏感性的方法 ? 增加标本用量，例如从500 μl 血浆增加到1 ml ? 离心沉淀病毒颗粒，离心时间从60min 延长到 80 min at 23,600 x g ? 减少内部定量标准的体积，例如从 25 μl 减少到 6.6 μl per lysis vial ? 减少沉淀的病毒重悬的体积，例如从 100 μl减少到 55 μl ? 加底物孵育时间延长10–15 min * * 假阳性(False Positive) 控制污染 　物理隔离PCR前后的反应 　器械专用（加样器、吸头、离心机、离心管、手　　　套、工作服、笔） 　分装试剂 　阳性和阴性对照 最近的进展 　防气溶胶吸头 　半自动操作 　封闭试管系统（实时PCR） 　全自动（样品处理＋扩增＋检测） * * 假阴性(False Negative) 原因 　序列变异 　丢失核酸样本 　核酸样品被消化 　抑制DNA聚合酶的活性 预防 　避免肝素、血红蛋白、乙醇、酚、SDS 　使用合适的提取技术 检测 　阳性对照 　内部对照 选择病毒载量检测的注意事项 方法的线性范围、特异性、重复性、对不同亚型的检测性能 检测试剂和耗材等消耗品 对人员和实验室的要求、可操作性 样本的运输、保存、样品量 质量控制：污染控制、室内控制和室间控制 自动化操作程度 检测时间 病毒载量测定的基本要求 仪器需要按公司要求的进行定期维护 加样器的校准 水浴箱的温度校准 实验室的处理 检测实验室的分区 婴幼儿HIV感染核酸检测 HIV感染产妇所生婴幼儿在出生后18个月内可应用HIV核酸（DNA或RNA）检测进行早期HIV感染诊断。尽管HIV RNA检测敏感性在感染早期较高（出生后1个月内），但是HIV DNA检测不受母亲围产期抗逆转录病毒治疗和人乳汁中抗逆转录病毒药物以及婴幼儿预防性抗逆转录病毒治疗的干扰而影响早期诊断。另外，考虑母亲血液污染因素，不推荐使用脐带血进行HIV核酸检测。 适用范围 未满18个月的HIV感染产妇所生婴幼儿；未满18个月的婴幼儿，其母亲HIV感染状态不详，儿童出现HIV相关临床表现，临床怀疑HIV感染者 检测程序及结果报告 滤纸片载体及其特性（1） 作为血液载体，滤纸应具备极强的吸水性、厚度均一、液体流速一致、纯度高、没有污染、FDA在册，据不同的检测需求选择不同类型的滤纸。 滤纸干血斑样本特点（1） 需要样本量少，仅50-100μl； 易采集，末梢血即可，适用婴儿和静脉采血困难者； 样本安全，生物危险性低，费用低廉的运输方式，可直接邮寄，被IATA归入最低危险水平； 室温保存减少了保存费用，密封袋中加干燥剂和湿度指示剂. 滤纸片载体及其特性（2） 滤纸选择指南 样本采集滤纸类型 检测对象 是否长时间常温保存 是否关心杀菌剂、杀毒剂、抗真菌成分 是否样本含有色素如：血液、粪便、血清、植物或哺乳细胞 样本是否为清洁的生物性液体入：口腔粘膜细胞、精液、尿液 DNA protein RNA SS 903 √ √ √ 否* 否 是 否 Isocode(FTA标准卡) √ 是 是 是 否 IsocodeID（FTA指示型卡） √ 是 是 否 是 *903滤纸上的样本可在-20℃长期保存，蛋白的保存时间依据特异蛋白特性，见后。 滤纸片干血斑作为一种有效载体在HIV检测中具有非常重要的作用 定性检测HIV抗体 定量检测HIV的病毒载量 HIV耐药性检测 HIV新发感染的检测 快速检测的一种质控手段 定性检测前病毒DNA,婴幼儿早期诊断 HIV耐药检测 抗病毒治疗的效果：  ●大幅度降低病毒载量 ●提升CD4细胞数 ●改善症状，延长生存期。 抗病毒治疗存在问题： ●毒副作用大 ●患者依从性差 ●耐药性毒株的出现 什么是HIV耐药性？ HIV耐药性是指病毒通过自身的遗传变异， 产生对药物抑制作用敏感性降低或不敏感 的现象。 Available Antiretroviral Agents Nucleoside Analogs AZT, zidovudine, Retrovir ddI, didanosine, VidexEC ddC, zalcitabine, Hivid d4T, stavudine, Zerit 3TC, lamivudine, Epivir abacavir, Ziagen FTC, emtricitabine, Emtriv