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2005-3-22 2003级 《分子生物学实验》 2005-3-21 2002级生物技术专业 2004-2005（下）分子生物学实验 哺乳动物基因组DNA的提取 实验一 储备液的制备 实验二 破碎细胞 实验三 分离、纯化DNA 实验四 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 一、实验目的 通过本实验了解并掌握提取动物基因组DNA的原理和步骤。 通过本实验熟练掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的实验技术。 熟练掌握分子生物学实验中各种仪器的使用方法及试剂的配制方法。 二、实验原理 天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA及无机离子等。在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动物基因组DNA。 用此方法得到的DNA大小为100-150 kb，适用于λ噬菌体构建基因组文库和Southern分析。 三、仪器、材料和试剂 （一）仪器 高速冷冻离心机、微量取样器、玻璃匀浆器、 琼脂糖凝胶电泳系统：电泳仪、水平电泳槽、 紫外透射仪（或凝胶成像分析系统）、 恒温水浴器、高压灭菌锅、超净工作台、 超低温冰箱、电子天平、酸度计 （二）实验材料、用具、药品 1.鼠肝或兔肝 2.1.5 mL微量离心管、微孔过滤器、 20mL注射器、各种型号的吸头 3.三羟甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、醋酸钠（NaAc）、平衡酚、氯仿、异戊醇、乙醇、琼脂糖、蛋白酶K、RNA酶、DNA相对分子质量标准物、硼酸、溴酚蓝、蔗糖 溴化乙锭（危险） （三）试剂 1. 5 mol／L NaCl 2. 0.5 mol／L Tris.HCl pH8.0 3. 0.5 mol／L EDTA pH8.0 4. 3 mol／L NaAc pH5.2 5. dddH2O 6. 生理盐水（0.85％ NaCl） 以上均高压灭菌 四、实验步骤 本实验在无液氮的条件下，制备鼠肝或兔肝DNA，与有液氮条件下相比，产量和质量都有所下降。 整个操作过程中，应尽量避免DNA酶的污染，特别注意动作温和，减少对DNA的机械损伤。 （一）储备液的制备（第一次） 1. 5 mol／L NaCl 2. 0.5 mol／L Tris.HCl pH8.0 3. 0.5 mol／L EDTA pH8.0 4. 3 mol／L NaAc pH5.2 5. dddH2O 6. 生理盐水（0.85％ NaCl） 以上均高压灭菌 7. 10mg／mL 蛋白酶K -20℃保存 8. 10mg／mL 无DNA酶的RNA酶 -20℃保存 9. 5×TBE 10. 6×凝胶加样缓冲液 （二）破碎细胞（第二次） 冰浴处理生理盐水 玻璃匀浆器 冰冷的生理盐水清洗 配制工作液 处死小鼠 取出肝脏 组织匀浆液 酶解液 2ml匀浆液 组织细胞液 玻璃匀浆器匀浆 移至1.5ml离心管 5000r／min30—60s 加400ul 吹散 加400ul 离心 无菌水 酶解液 水浴处理（55℃、12—18h） （三）分离、纯化DNA （第三次） 等量分装在两支离心管内 加入20ul的RNase 加入等体积①提取液500ul 4℃ 10min 酶解样品 待抽提的样品 抽提 静置 离心 配制 TE缓冲液 加等体积②提取液500ul 10000r／min离心10min 4℃ 10min 移出水相 至离心管 抽