细胞工程—单抗读书笔记.docxVIP

实验设计 转化 PCR检测及培养 转染|瞬时表达亲和色谱柱纯化抗体 ELISA检测抗性 细胞增殖抑制试验|WST—8检测抑制效果 BT—474 胸腺癌细胞增值 SK—BR—3 检测细胞凋亡情况 MCF—7“重组抗HER2人源化单克隆抗体的瞬时表达及其抗肿瘤活性”这篇文章是对课本的十一章和十二章知识的整合和医学方面的实际应用，有较大的难度。需要对书上关于单克隆抗体部分和动物表达制药蛋白知识通读理解的基础上，对文献重点解读和掌握。粗读两遍又精读了多遍都没有形成一点实验思路，梳理完实验思路方法才理解文章的大体走向，然后又重读了两遍才掌握这篇文章。现在，在我看来，这篇文章其实很简单，主体就是抗体中和抗原（HER2原癌基因编码的糖蛋白），从而抑制乳腺癌细胞的增值表达，细节就是抗体的制备、纯化、检测制成外源基因，外源基因的转染表达，对细胞增殖抑制的检测等。而单克隆抗体不难理解，就是一种单一的，对特定的抗原决定簇产生反应的抗体。在大致了解文章思路的基础上，对这篇文章每个环节进行了研读分析，并结合老师课堂的知识进行了理解。瞬时基因表达（transient expression ,TEG）相较于传统的稳定表达工艺而言效率更高、更加节省人力、物力和时间。通过该项技术可以在快速生产毫克至克级别，在分子结构、理化性质和药学特性和接近原始存在的重组蛋白分子，可以满足新药的筛选和临床前研究检测等药物研究阶段对重组蛋白的巨大需求。而本文实用的阳离子聚合物——聚乙烯亚胺（PEI）介导的转染在无血清条件下进行，是目前报道的工业化、大规模瞬时表达重组蛋白领域最广泛使用的基因载体和转染试剂。哺乳动物瞬时表达系统使用最多转染细胞有：COS、HEK 293、CHO三种。COS和HEK 293细胞的转染效率比较高，CHO的转染效率较低一些，HEK 293和CHO目前实现了无血清的悬浮培养，COS只能在有血清的系统中培养。而本文采用的是PEI介导的无血清转染系统，满足瞬时高效的目的，就不难理解为何本文选择HEK 293作为转染细胞了。 就实验技术而言不得不提的就是转染参数的优化，高等哺乳动物的转染效率较低，要想获得瞬时大量的表达，必须对转染工艺进行优化。本篇文章选取A—细胞浓度，B—DNA浓度和C—DNA/PEI比例三种因素，设置三种水平做了正交试验，进行最佳转染条件的探索。（三因素三水平表设置见表2）。当然其他一些影响因素如转染培养基的PH和转染时间也是比较重要的影响PEI介导转染因素。 将抗HER2人源化单克隆抗体真核表达载体,转化到感受态大肠埃希菌DH5a，在大肠杆菌中进行扩增，中量的质粒一般采用Plasmid Midi Kit试剂盒抽提。然后与带有大量正电荷的PEI通过静电作用形成纳米级PEI/DNA正电复合物，带有正电荷的复合物同样通过静电作用与带负电的细胞膜进行结合，由非特异性的内吞作用进入细胞内。复合物从内吞小泡中逃逸、质粒DNA进入细胞核，DNA被转录为mRNA，随后被翻译成蛋白质。通过流式细胞仪对胸腺癌细胞HER2表达量进行检测，快速测量其生物物理，生物化学方面的特性，用带有PE荧光标记的抗体与胸腺癌细胞HER2进行特异性的结合，检测其荧光强度，荧光强度越高，活性就越强。检测完后用WST—8检测我们的重组抗HER2人源化单克隆抗体对BT—47 、SK—BR—3和 MCF—7细胞的生长抑制作用，通过阳性对照组和阴性对照组和实验组观察抗体对于诱导胸腺癌细胞凋亡的作用。实验结果表明了，将瞬时转染获得的rhHER2_mAb纯化后惊醒抗肿瘤活性考察，对于HER2高表达的乳腺细胞株抑制作用显著。也间