11第十一章：基因表达和功能研究.ppt

限制性切点插入寡核苷酸链（图11-23c） 插入的寡核苷酸的序列需符合下述条件：附加的片段能使这个蛋白质中的有关的氨基酸序列形成一个新的结构，或者它能够使已经存在的结构更加稳定。 无论是酶切除还是插入片段操作应该特别注意的是不能改变整个核苷酸编码氨基酸的读码框。 还有寡核苷酸定向诱变法（oligonucleotid-directed mutagenesis），利用这种技术，我们可以在一个基因的任何一个位点上产生一个突变。 (d ）单核苷酸诱变 寡核苷酸诱变法 利用寡核苷酸诱变法（oligonucleotid mutagenesis）,借助于寡核苷酸在一个基因的任何一个位点上产生一个突变，可以在被克隆的基因中产生一个点突变——基因的点突变。 b、基因的（定向）点突变 寡核苷酸改变，可以在被克隆的基因中产生一个点突变；进行寡核苷酸诱变，必须具有这个基因的单链形式，普遍采用的方法是将它克隆到M13-载体上进行。 寡核苷酸诱变操作过程 ?首先对相应基因的单链DNA进行纯化，确定进行突变操作区域的序列。 ?合成一个与该区域互补的、含有核苷酸改变的短寡核苷酸链（如图11-24a中，AAT变成了ATA，所编码的氨基酸就从天冬酰胺变成了酪氨酸）。一个这样的寡核苷酸链，尽管有一个错配对的碱基，还是能与这个DNA-单链进行杂交，通过DNA-聚合酶I的Klenow-片段合成互补链获得双链重