葛根素对氧自由基you导的豚鼠耳蜗微血管内皮细胞凋亡和bcl-x- 2cl- 2fbax表达的影响.docxVIP

华中科技大学硕士学位论文材料和方法一、主要仪器37℃恒温培养箱倒置相差显微镜PCR扩增仪HMISAS-2000型全自动流式细胞仪德国 Heraeus日本 Olympus M08型杭州博日 PC-XP-D型同济千屏影象工程公司医学彩色图文分析系统Becton Dickinson二、主要试剂葛根素氧自由基DMEM培养液胰蛋白酶透明质酸酶胎牛血清鼠尾胶原SABC试剂盒DAB试剂盒Ⅷ因子抗体反转录试剂盒Taq酶Bcl-xL、Bax引物4山东鲁抗制药Sigma公司Hyclone公司Sigma公司Sigma公司Hyclone公司Hyclone公司武汉博士德生物公司武汉博士德生物公司武汉博士德生物公司日本 Toyobo公司Fermentas公司上海 Sangon公司华中科技大学硕士学位论文三、实验动物重量 200-300g的正常杂色豚鼠，为中科技大学同济医学院动物实验中心提供。四、实验方法1.豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的培养，纯化，及鉴定豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的培养参照魏运军等[6]的方法并改进。1.1豚鼠耳蜗血管纹组织的分离选取重量 200-300g的正常杂色豚鼠 10只，雌雄不限。以 1%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉，断头，取出双侧听泡，用 75%酒精浸泡 5分钟，浸入 D-Hanks液中，解剖显微镜下剪去听泡骨壁，刮除耳蜗表面的骨膜，钩破蜗尖，自顶回至基底回完整剥离出耳蜗外侧壁软组织，仔细分离出含深色色素的血管纹，并将其切碎成 0.5mm大小的微小组织块，均匀平铺于直径为 35mm的培养皿中备用。1.1.2胶原酶消化法及细胞纯化养皿中加入 3ml 0.1%Ⅳ型胶原酶(Sigma)工作液，置 37℃恒温箱中振荡消化 1小时，去除未消化掉的组织残块，离心(1000g/10min)，所得沉淀加入含 25%胎牛血清的 DMEM培养液，并接种于直径 35mm的培养皿中(事先加有鼠尾胶原)，置 5%CO2，37℃培养箱中培养 2-7天内，可观察到培养皿底有多个细胞岛形成，每三天更换 1/2的培养液，同时每日在倒置显微镜下刮去散在的可疑杂细胞，15-30天后，当细胞已接近长满培养皿底时，0.5%胰蛋白酶消化 5min，按 105/cm2的细胞密度接种传代，台眙蓝染色并计数。1.1.3内皮细胞的鉴定培养皿底放入盖玻片并固定，将培养细胞接种其中，将生长于盖玻片上的第四代培养细胞用 4%多聚甲醛固定，PBS冲洗后加 3% H2O2-甲醇 37℃孵育 30min，10%羊血清封闭，加入 1：100的兔抗鼠Ⅷ因子抗体 4℃湿盒过夜，PBS冲洗 3次后加入1：100的羊抗兔 IgG，充分冲洗后加入 1：100三抗，DAB显色，复染液复染后摄片，空白对照用 PBS代替Ⅷ因子抗体，其余步骤不变，阴性对照则使用豚鼠肝细5华中科技大学硕士学位论文胞。2.药物实验：将 24孔板分为 5个组：空白对照组、氧自由基组、葛根素处理组，葛根素处理组又分为三个浓度组，每组设 5个复孔。将葛根素按终浓度配制为 0.5mmol/L，1.0mmol/L， 3.0mmol/L；用培养液作为溶剂，配成 3-30ul母液，分别加入葛根素预处理组的相应培养孔内，对照组及氧自由基组则加入等体积相同培养液做对照。培养箱中继续培养 12小时。3.黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶产生 OFR损伤耳蜗微血管内皮细胞模型的建立在葛根素作用 12小时后的葛根素预处理组及未经葛根素作用的氧自由基组的培养基中加入次黄嘌呤 (终浓度为 0.1mmol/L)和黄嘌呤氧化酶溶液 (终浓度为 0.05U/ml)，作用 60分钟后用 D-Hanks液洗两遍，然后换上含 10%胎牛血清的 DMEM培养液，37℃，5% CO2培养箱中继续培养，对照组不加氧自由基，其他处理同上。培养 24小时后，取出培养有豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的盖玻片，4%多聚甲醛固定 30分钟，PBS液漂洗 5分钟，重复 3次。分组标记。4.流式细胞术检测细胞凋亡率主要检测指标为凋亡细胞所占百分比(%)，经上述各组耳蜗微血管内皮细胞经胰酶消化后用吸管轻柔吹打成单细胞悬液后，加 0.1mol/L PBS，离心洗 2次，加入2mL冷 70%乙醇固定，调整细胞浓度为 1x106cells/mL，室温放置 30min后，离心，检测前加入碘化丙啶(propidiumiodide，PI)染色，300目筛网过滤处理后，置流式细胞仪中进行细胞周期和细胞凋亡的测定，按细胞周期曲线上出现的凋亡细胞峰计算各时间点凋亡细胞所占百分比(%)。全部操作在华中科技大学附属同济医院中心实验室完成，流式细胞仪(BectonDickinson)的工作条件为氩离子激光器 Innova9025激光功率为 15mV，激光波长为 488nm，检测结果经过 B.D.公司 Cell QuEST和ModFIF