gpcrsgi1α融合基因及chopcdna3.1gpr91工程细胞株的构建-construction of gpcr sgi 1α fusion gene and chop cdna 3.1 gpr 91 engineering cell strain.docx
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gpcrsgi1α融合基因及chopcdna3.1gpr91工程细胞株的构建-construction of gpcr sgi 1α fusion gene and chop cdna 3.1 gpr 91 engineering cell strain
英文缩略词表Abbreviations缩略词英文全称中文全称APAmmoniumpersulfate过硫酸胺BacmidBaculovirusplasmid杆粒BEVSBaculovirusExpressionvectorsystem杆状病毒表达载体系统BlastBasiclocalalignmentsearchtool碱基比对检索程序cDNAComplementarydeoxyribonucleicacid互补脱氧核糖核酸DEPCDiethtypyrocarbonate焦碳酸二乙酯DMEMDulbecco’smodifiedeaglemedium改良Eagle培养基DMSODimethylSulfoxide二甲亚砜E.coliEsherichiacoli大肠杆菌ECMExtracellularmatrix细胞外基质FBSFetalbovineserum胎牛血清GPCRGprotein-coupledreceptorG-蛋白偶联受体HRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶IPTGIsopropyl-β-Dthiogalactoside异丙基-β-D硫代半乳糖苷KbKilobase千碱基对kDaKilodalton千道尔顿LBLuria-BenrtainmediumLB培养基MCSMulticlonesite多克隆位点mRNAMessengerRNA信使RNANCBINationalCenterforBiotechnologyInformation美国国家生物技术信息中心oGPCRODOrphanGprotein-coupledreceptorOpticaldensity孤儿G蛋白偶联受体光密度值ORFOpenreadingframe开放阅读框PAGEPolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSphosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应PMSFPhenylmethanesulfonylfluoride苯甲基磺酰氟rpmRotateperminute每分钟转数RT-PCRReversetranscription-polymerasechain逆转录-聚合酶链反应SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠SOE-PCRSplicingbyoverlapextensionPCR重叠延伸PCRTBSTrisbufferedsalineTris缓冲盐溶液TEMEDN,N,N’,N’-tetramethylethylenediamineN,N,N’,N’-四甲基乙二胺WBWestern-blot免疫印迹X-gal5-bromo-4-cholro-3-indolyl-β-D-galactoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷GPCRs-Gi1α融合基因及CHO-pcDNA3.1(+)-GPR91工程细胞株的构建中文摘要G蛋白偶联受体(Gprotein-coupledreceptors,GPCRs)是一大类通过G蛋白介导其生物效应的膜受体总称,也是最大的膜受体家族,其成员均参与了广泛的病理生理过程,GPCRs因介导细胞间通讯和细胞内信息传递而具有重要的生理功能和病理意义,因此GPCRs也一直是新药发现及研究的最重要靶点。迄今为止,以GPCRs为靶点的药物数量约占了市售药物的40%-50%。在总数为900个左右的GPCRs中,约有100个配基与功能均属未知的GPCR,被称为孤儿GPCRs(orphanGPCRs,oGPCRs)。由于GPCRs在病理生理以及药物研究方面的重要作用,确认oGPCRs的内源性配基及其作用机制已经成为了研究GPCRs的重要课题。对oGPCRs的特异性配基的发现和研究,被形象地称作称作“去孤儿化”。oGPCRs的一旦成功实现了“去孤儿化”,对于相关疾病发病机制的阐明以及新药的研究发现有着重要的意义。为了能更快捷有效地对GPCRs的内源性配基及其作用机制进行探讨,我们设计了相应的研究课题。本研究主要包括两部分:第一部分是利用GPCR与G蛋白α亚基偶联的特性,将几个GPCR分子与G蛋白α亚基进行基因融合,为实现GPCR的配基筛选做准备;第二部分则是是构建了CHO-pcDNA3.1(+)-GPR91工程细胞株,为深入研究GPR91的作用机制奠定了基础。在本实验第一部分中,我们分别将GPR91,GPR119,GPR84与Gi1??进行基因融合。首先通过分子克隆得到了其全长序列,之后与pMD18-T载体相连接构建重组质粒,再以重组质粒为模板,通过重叠延伸PCR技术将GPCRs与Gi1??序列进行融合。将融合基因克隆到供体质粒pFASTBac1中得到重组质粒
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