hif1在心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用及脯氨酰羟化酶sirna对其表达的影响-the role of hi f1 in myocardial hypoxia-reoxygenation injury and the influence of prolyl hydroxylase sirna on its expression.docxVIP

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2018-05-29 发布于上海
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hif1在心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用及脯氨酰羟化酶sirna对其表达的影响-the role of hi f1 in myocardial hypoxia-reoxygenation injury and the influence of prolyl hydroxylase sirna on its expression.docx

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hif1在心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用及脯氨酰羟化酶sirna对其表达的影响-the role of hi f1 in myocardial hypoxia-reoxygenation injury and the influence of prolyl hydroxylase sirna on its expression

目录一、目录………………………………………………………………………………1二、缩略词表…………………………………………………………………………2三、摘要………………………………………………………………………………3中文摘要………………………………………………………………………3英文摘要………………………………………………………………………6四、正文………………………………………………………………………………8前言……………………………………………………………………………9实验材料……………………………………………………………………11（一）主要试剂…………………………………………………………………11（二）主要器材………………………………………………………………12（三）主要试剂的用途及配制…………………………………………………12实验方法……………………………………………………………………14（一）SD乳鼠心肌细胞的原代培养及鉴定……………………………………16（二）实验分组设计……………………………………………………………16（三）P4HA2·siRNA载体构建的技术路线与研究方法…………………………18（四）P4HA2·siRNA载体对HIF-1α蛋白及其下游靶基因表达的检测……35实验结果……………………………………………………………………36讨论……………………………………………………………………………49结论…………………………………………………………………………52五、参考文献…………………………………………………………………………53六、致谢………………………………………………………………………………56七、综述………………………………………………………………………………571缩略词表缩略词英文中文MRH/RMyocardiaischemiaReperfusionhypoxia-reoxygenation心肌缺血再灌注缺氧/复氧cTnICardiacTroponinI肌钙蛋白IVHLVonHippel－Lindau肿瘤抑制蛋白cDNAComplementarydeoxyribonucleicacid互补脱氧核糖核酸Brdu5-bromodeoxyuridine溴脱氧尿苷RT－PCRreversetranscriptionpolymerasechainreaction逆转录PCRDEPCdiethylprocarbonate二乙基焦碳酸酯HIF-1Hypoxia-induciblefactor-1缺氧诱导因子-1PI3KCHDHO-1phosphatidylinositol3-kinasecoronaryatheroscleroticheartdisehemeoxygenase-1ase磷脂酰肌醇-3激酶冠心病血红素氧合酶-1VEGFvascularendothelialgrowthfactor血管内皮生长因子GLUT－1glucosetransporter-1葡萄糖转运蛋白-1ICAM-1intercellularcelladhesionmolecule-1细胞间黏附分子-12缺氧诱导因子-1在心肌细胞缺氧复氧损伤中的作用及脯氨酰羟化酶siRNA对其表达的影响中文摘要目的利用小干扰RNA干预体外培养的大鼠心肌细胞中缺氧诱导因子－1α（HIF－1α）的生成，探讨其对在模拟心肌缺血再灌注损伤时在缺氧/复氧（hypoxia-reoxygenation，H/R）损伤方面对心肌细胞功能的修复，以及HIF－1α的变化对下游靶基因水平的影响，在临床治疗和预防患者的心肌梗死患方面提供心肌缺血再灌注损伤相关的治疗新思路。方法（1）取1-2天的SD乳鼠心肌细胞进行原代培养，雌雄随机，对分离纯化的心肌细胞进行形态学方面的观察和鉴定，选取介入模拟缺氧复氧条件时细胞自发生长的最佳时间，设计并构建乳鼠的心肌细胞体外缺氧/复氧（H/R）模型（2）设计并建立缺氧复氧模型，将分离纯化后已培养第3至4天的SD乳鼠原代心肌细胞等量随机分成3组，具体分组方式为：①正常对照组（质量控制及对照Control组）；②缺氧/复氧（H/R）组；③siRNA转染后的乳鼠心肌细胞缺氧/复氧（P4HA2·siRNAH/R）组；（3）缺氧复氧模型构建完成后，将培养好的各组心肌细胞分别置于倒置显微镜下，进行细胞形态学方面的观察和计数，包括计数各分组细胞的搏动频率、存活率以及各分组心肌细胞在形态学方面的变化；检测心肌细胞的增殖情况，形态改变情况以及存活率变化（MTS法）；（4）构建并鉴定P4HA2小干扰RNA（siRNA），制备慢病毒载体，转染大鼠心肌细胞；（5）采用SYBRGreen荧光定量PCR法扩增，检测HIF-1α在各组心肌细胞缺氧复氧模型中的表达水平；用化学发光