(免疫检测技术知识）第3章 特异性抗体的制备技术知识-modified.ppt

细胞性抗原： （1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次 可溶性抗原： 首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫 。 抗原接种 常规免疫法 脾内一次性免疫法 短程免疫法 体外免疫法 常用免疫方法： “稳妥；优势克隆” 皮下注射 腹腔注射 静脉注射 免疫途径： “省时；省抗原” “省时” “操作繁琐” 常规免疫法： 第1次免疫：抗原+福氏完全佐剂 第2次免疫：抗原+福氏不完全佐剂 第3次免疫：抗原+不加佐剂 第4次免疫：抗原+不加佐剂 (皮下注射或静脉注射) (皮下注射) (皮下注射) (静脉注射) 二、细胞融合及HAT筛选 病毒介导的细胞融合 PEG介导细胞融合 电激融合 1、细胞融合方法： 细胞悬液的制备与融合 (1) 脾细胞悬液的制备：最后一次免疫后第3天制备 (2) 骨髓瘤细胞悬液的制备：于对数生长期制备 (3) 细胞融合：50%PEG(1000~4000), pH8.0, 38oC, 1min 细胞融合剂： PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合 作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同 SP2/0细胞与脾细胞的比例为1：2～5 1ml 50%的PEG（无菌，预温37℃）在1分钟内滴完,静置90秒,时间一到,将事先准备的培养液一滴一滴加入,停止PEG作用 根据细胞数量加入HAT培养基，使之分加到96孔板中时每孔细胞数为（0.5～1.5）×105个。融合后7天，换用HT培养液 细胞融合方法 3、HAT培养基的筛选 融合后细胞混合液 HAT培养基 2 weeks later HT培养基 正常培养基 1 week later 培养液： RPM1640培养液 DMEM培养液 培养骨髓瘤细胞： 选择对数生长期的细胞进行传代培养 细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐 避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞 注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存于-80℃或液氮及干冰中 免疫脾细胞的制备： 1×108的淋巴细胞 无菌手术 饲养细胞： 细胞密度过低不利于细胞生长繁殖 常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞 其中MQ还有清除死亡细胞的作用 饲养存活一般不超过2周，不影响杂交瘤细胞的纯化 骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3) 50% PEG 1min内加完; 2min内加10ml培养液 融合方法 HGPRT酶与TK酶： 次黄嘌呤磷酸核糖转化酶 胸腺嘧啶核苷激酶 （四）杂交瘤细胞的选择性培养 应用液： 8-杂氮鸟嘌呤 聚乙二醇 HAT培养基： H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA HAT选择作用： 淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断 骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻 细胞融合的选择培养基中有3种关键成分：次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、甲氨蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T），所以取三者的字头称为HAT培养基。甲氨蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的HGPRT-细胞株，所以不能在该培养基中生长。只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在HAT培养基中长期存活与繁殖。 SP2/O: HGPRT- ，TK-;　长命 脾细胞: HGPRT+ ，TK+ ;短命(7天) 杂交瘤细胞:HGPRT+ ，TK+; 长命 骨髓瘤细胞、脾细胞与杂交瘤细胞 第5章 特异性抗体的制备技术 抗体种类 第一代抗体 多克隆抗体（polyclonal antibody) 第二代抗体 单克隆抗体（monoclonal antibody) 第三代抗体 基因工程抗体（genetic engineering antibody) 多克隆抗体制备 多克隆抗体的产生示意图 多克隆抗体(polyclonal antibody,pcAb)：天然抗原刺激多种B淋巴细胞克隆产生的多种抗体的混合物 　　动物脾脏有上百万种 不同的B淋巴细胞系，重排后具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个 具有不同基因的B 细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。 如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成