il17作为分子佐剂增强hiv核酸疫苗细胞免疫应答的分析-analysis of il 17 as molecular adjuvant to enhance cellular immune response of hiv nucleic acid vaccine.docx

2.4.2pET28a-IL-17表达载体的制备172.4.3诱导目的基因的相关蛋白在大肠杆菌中的表达182.5亚克隆目的基因到真核表达载体并检测重组质粒的表达202.5.1主要材料202.5.2实验方法212.5.3结果242.6小结262.7本研究证明262.8结论与展望27第三章分子佐剂对HIV核酸疫苗免疫效果的研究293.1细胞因子佐剂的制备303.1.1主要材料303.1.2方法303.1.3结果303.2IL-17作为HIV核酸疫苗免疫佐剂效果的研究303.2.1实验材料313.2.2实验动物313.2.3主要试剂313.2.4方法343.2.5结果373.3讨论423.4小结433.5展望43结论44参考文献45附录51附录一缩略词表51附录二实验主要仪器53附录三pGX-Env和pcDNA3-IL-17的重组质粒图谱及序列54（一）pGX-Env：54（二）pcDNA3-IL-17：59致谢60个人简历及发表文章61第一章文献综述1.1艾滋病、艾滋病病毒和疫苗艾滋病简介艾滋病，即获得性免疫缺陷综合征。英语缩写AIDS(AcquiredImmuneDeficiencySyndrome)的音译。当一个人感染了艾滋病病毒以后，此病毒就开始攻击人体免疫系统。经过几年，艾滋病病毒削弱了免疫系统抗病毒的能力甚至这种能力完全消失。这个时候，机体受外缘物质感染的机会就大大增加从而患病的几率也随着增大，如肺炎、脑膜炎、肺结核等。一旦有机会性感染发生，这个人就被认为是患了艾滋病[1-3]。艾滋病本身不是一种病，而是一种无法抵抗其它疾病的状态或综合症状。人不会死于艾滋病，而是会死于与艾滋病相关的疾病。艾滋病病毒艾滋病病毒，即人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus，HIV)，它会造成人类免疫系统的缺陷。人类免疫缺陷病毒于1981年在美国首次被发现[4]。它是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒(Lentivirus)，属反转录病毒的一种。世界上至今也没有一种完全有效的方法来治疗这种致命性传染病。该病毒破坏人体的免疫能力，导致免疫系统的失去抵抗力，从而导致各种疾病及癌症得以在人体内生存，发展到最后，导致艾滋病(获得性免疫缺陷综合征)。病毒的抗原结构人类免疫缺陷病毒直径约120nm，大致呈球形。病毒外膜是磷脂双分子层，来自宿主细胞，并嵌有病毒的蛋白gp120与gp41；gp41是跨膜蛋白，gp120位于表面，并与gp41通过非共价作用结合。向内是由蛋白p17形成的球形基质(Matrix)，以及蛋白p24形成的半锥形衣壳(Capsid)，衣壳在电镜下呈高电子密度。衣壳内含有病毒的RNA基因组、酶(逆转录酶、整合酶、蛋白酶)以及其他来自宿主细胞的成分。病毒基因组结构和功能病毒基因组是两条相同的正义RNA，每条RNA长约9.2-9.8kb。两端是长末端重复序列(longterminalrepeats,LTR)，含顺式调控序列，控制前病毒的表达。已证明在LTR有启动子和增强子并含负调控区。LTR之间的序列编码了至少9个蛋白，可分为三类：结构蛋白、调控蛋白、辅助蛋白。(1)gag基因能编码约500个氨基酸组成的聚合前体蛋白，经蛋白酶水解形成P17，P24核蛋白，使RNA不受外界核酸酶破坏。(2)Pol基因编码聚合酶前体蛋白，经切割形成蛋白酶、整合酶、逆转录酶、核糖核酸酶H，均为病毒增殖所必需。(3)env基因编码约863个氨基酸的前体蛋白并糖基化成gp160，gp120和gp41。gp120含有中和抗原决定簇，已证明HIV中和抗原表位，在gp120V3环上，V3环区是囊膜蛋白的重要功能区，在病毒与细胞融合中起重要作用。gp120与跨膜蛋白gp41以非共价键相连。gp41与靶细胞融合，促使病毒进入细胞内。实验表明gp41亦有较强抗原性，能诱导产生抗体反应[5-7]。以上3种编码蛋白的基因是决定HIV病毒进入机体并能够完成逆转录关键基因。除此之外还有TaT、Rev、Nef、Vif、VPU、Vpr等基因[8-10]。HIV-2基因结构与HIV-1有差别：它不含VPU基因，且有一功能不明的VPX基因。核酸杂交法检查HIV-1与HIV-2的核苷酸序列，仅40%相同。env基因表达产物激发机体产生的抗体无交叉反应。艾滋病疫苗1993年Wang等选用HIV-1病毒的包膜蛋白基因作为抗原，发现注射这种质粒DNA可激活动物体内产生中和抗体和细胞毒性的T淋巴细胞[11]。它们在体外的HIV感染系统中可以有效地阻止HIV病毒进入机体和消除已经感染病毒的机体细胞。其中，猴子在注射了膜蛋白的DNA疫苗后，它们产生了不同程度的抗感染能力。目前利用HIV的Gag、Pol、Env(gp120和gp160)基因、调节基因(nef、rev、vif、vpr、