结肠癌5-fu耐药株的建立及其生物学特性和相关耐药机制的探索-establishment of 5 - fu resistant colon cancer strain and its biological characteristics and exploration of related drug resistance mechanism.docx

目录主要缩略词及中英文对照表………………………………………………...1中文摘要……………………………………………………………………...2ABSTRACT…………………………………………………………………..4前言…………………………………………………………………………………………6材料与方法……………………………………………………………………..9结果…………………………………………………………………………...18讨论…………………………………………………………………………...25参考文献………………………………………………………………………28综述……………………………….…………………………………………31致谢……………………………….…………………………………………43主要缩略词及中英文对照表BSAbovineserumalbumin牛血清白蛋白DMSOdimethylsulfoxide二甲基亚砜EDTAethyldiaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸二钠PBSphosphatebufferedsaline磷酸盐缓冲液ODopticaldensity光吸收度SDSsodiumdodecylsulphate十二烷基硫酸钠Tristris(hydroxymethl)aminomethane三羟甲基氨基甲烷mRNAmessageRNA信使核糖核酸RT-PCRrealtimepolymerasechainreaction实时定量聚合酶链反应MGMTO(6)-Methylguanine-DNAMethyltransferaseO6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶TBSTTris-BufferedSalineTween-20磷酸盐吐温缓冲液5-Fu5-Fluorouracil5-氟尿嘧啶CCK-8CellCountingKit-8CCK-8试剂盒IC50thehalfmaximalinhibitoryconcentration半数抑制浓度PIPropidiumIodide碘化丙啶ggram克hhour小时μMmicromoleperlitre微摩尔每升结肠癌5-FU耐药株的建立及其生物学特性和相关耐药机制的探索研究生：张小明指导教师：马建华副教授华中科技大学同济医学院附属协和医院胃肠外科中文摘要目的：建立耐5-氟尿嘧啶（5-Fu）的人结肠癌DLD-1细胞系的肿瘤耐药株（DLD-1/5-Fu）,研究亲本和耐药株在形态学、倍增时间、5-Fu耐药性、细胞周期分布等生物学特性上的差异。检测亲本和耐药株在肿瘤干细胞占有比例、多药耐药蛋白P-gp及DNA修复蛋白MGMT表达水平上的差异以探索三者是否与结肠癌的5-Fu耐药有关。方法：采用持续接触浓度递增诱导法建立人结肠癌耐药株DLD-1/5-Fu；使用高倍显微镜观察细胞的形态改变情况并摄片；CCK-8法绘制亲本和耐药株的生长曲线，并计算细胞倍增时间；CCK-8法检测DLD-1和DLD-1/5-Fu的半数抑制浓度（IC50），并计算耐药指数（RI）；流式细胞术分析细胞周期分布情况；流式细胞术检测两种细胞中CD133+，即结肠癌干细胞的比例；WesternBlot检测多药耐药蛋白P-gp和DNA修复蛋白MGMT的蛋白表达量；RT-PCR检测MGMT的mRNA表达量。结果：使用初始浓度为0.2μM的5-Fu作用于DLD-1细胞系，待其重新生长铺满培养瓶底90%时增加药物浓度，依次至浓度为200μM为止，并能在含200μM药物浓度的培养基中稳定生长，历时约8个月成功建成耐药株DLD-1/5-Fu。光学显微镜下示亲本和耐药株在形态上有明显差异，耐药株细胞形态不规整，呈分支状，胞内似乎有颗粒状物，但细胞大小相似。CCK-8法测得耐药株比亲本细胞生长增殖缓慢，两者的倍增时间分别为50.35±2.88h和42.61±2.17h，P＜0.05。CCK-8法测得耐药株的IC50为985.43±163.64μM，而亲本细胞株的IC50为7.65±3.22μM，DLD-1/5-Fu的耐药指数（RI）高达128.81，两者比较有显著差异（P＜0.01）。流式细胞术显示耐药株中的G0/G1期细胞数增多，而S期和G2/M期细胞数减少，其中G0/G1和G2/M期在两株中比较有统计学意义（P＜0.05）。流式细胞术显示耐药株中的CD133+细胞比例低于亲本细胞，两者比较有统计学意义（P＜0.05）。Westernblot显示耐药株中P-gp和MGMT的蛋白表达量均显著高于亲本细胞株（P＜0.01），约为后者的两倍。RT-PCR显示耐药株中MGMT的mRNA的表达水平比亲本细胞高（P＜0.05），但增高幅度没有其蛋白水平明显。结论：成功建立人结肠癌细胞系DLD-1的5-Fu耐药株DLD-1/5-Fu，亲本细胞株和耐