结核分枝杆菌hsp16.3对小鼠m1型巨噬细胞作用的研究-study on the effect of mycobacterium tuberculosis hsp 16.3 on mouse m1 macrophages.docx

结核分枝杆菌Hsp16.3对小鼠M1型巨噬细胞作用的研究摘要目的：构建M1型和M2型巨噬细胞极化平台，观察Hsp16.3对M1型巨噬细胞的作用，并初步探讨其作用机制，为深入探讨Hsp16.3对巨噬细胞极化的作用及机制奠定基础。方法：（1）构建骨髓来源巨噬细胞M1型和M2型极化的技术平台,从Balbc小鼠的胫腓骨中取出骨髓细胞，与GM-CSF共培养得到骨髓来源巨噬细胞M0。用IFN-r诱导M0向M1型极化，用IL-4诱导骨髓来源巨噬细胞向M2极化。荧光定量PCR、ELISA检测IL-12、iNOS、TNF-α、Arg1、IL-4、IL-10、TGF-β细胞因子的表达水平，光镜下观察巨噬细胞的形态。（2）用荧光定量PCR、ELISA分别检测结核分枝杆菌Hsp16.3对M1型巨噬细胞Arg1、IL-10、iNOS、TGF-β、TNF-α表达水平的影响。（3）Westernblot检测结核分枝杆菌Hsp16.3对M1型巨噬细胞MAPK、TRAF6、NF-κB、iκB表达水平的影响。（4）siRNA-TLR4、PMB抑制TLR4的功能后，用荧光定量PCR、ELISA分别检测结核分枝杆菌Hsp16.3对M1型巨噬细胞IL-12、iNOS、TNF-α、Arg1、IL-4、IL-10、TGF-β、IL-6表达水平的影响；用Westernblot检测结核分枝杆菌Hsp16.3对M1型巨噬细胞MAPK、TRAF6、NF-κB、iκB表达水平的影响。结果：（1）荧光定量PCR、ELISA结果显示M1型巨噬细胞的IL-12、iNOS、TNF-α细胞因子的表达水平升高；在光镜下观察诱导得到的骨髓来源巨噬细胞呈现梭形，长突触。荧光定量PCR、ELISA结果显示M2型巨噬细胞的Arg1、IL-4、IL-10、TGF-β细胞因子的表达水平升高；在光镜下观察诱导得到的骨髓来源巨噬细胞伪足较短，形态收拢。（2）荧光定量PCR、ELISA结果显示结核分枝杆菌Hsp16.3引起M1型细胞因子iNOS、TNF-α表达量下降，M2型细胞因子Arg1、IL-10、TGF-β表达量升高。光镜下，M1型巨噬细胞的伪足缩短。（3）Westernblot结果显示结核分枝杆菌Hsp16.3抑制MAPK、TRAF6、NF-κB、iκB的表达水平。（4）通过siRNA-TLR4、PMB抑制TLR4受体功能后，荧光定量PCR、ELISA结果显示M1型巨噬细胞的M2型细胞因子IL-10、Arg1、TGF-β的表达量下降，M1型细胞因子iNOS、IL-6、IL-12的表达量升高。Westernblot结果显示结核分枝杆菌Hsp16.3抑制MAPK、TRAF6、NF-κB、iκB的表达水平。结论：（1）成功诱导小鼠骨髓来源的M1、M2型巨噬细胞；（2）结核分枝杆菌Hsp16.3可以促进M1型巨噬细胞高表达M2型相关的细胞因子，可促进M1型巨噬细胞向M2样巨噬细胞转换；（3）结核分枝杆菌Hsp16.3对M1型巨噬细胞的作用机制,可通过TLR4所介导的MAPK-NF-κB信号通路发挥作用。关键词：TLR,巨噬细胞,巨噬细胞极化TheeffectofMTBHsp16.3onM1macrophageofmouseAbstractObjective:TobuildapolarizationplatformofM1andM2macrophageandobservethepolarizationofM1macrophageafterstimulationwithMTBHsp16.3,providingafoundationtodiscussthepolarizationmechanismofmacrophageindepth.Methods:BuildingapolarizationplatformofM1andM2macrophage.BonemarrowcellswereextractedfromthetibiaandfibularofBalb/cmice.M0macrophagewasgetedbyco-cultureGM-CSFwithbonemarrowcells.IFN-rwasusedtoinducedM1macrophagefromMacrophageM0.M2macrophagewasinducedfromM0macrophagebyIL-4.QuantitativeRTPCRandELISAwereusedtodetecttheexpressionofIL-12,iNOS,TNF-α,Arg1,IL-4,IL-10andTGF-β.Themorphologyofmacrophagewereobservedunderthemicroscope.TheexpressionofArg1,IL-