节旋藻色基裂合酶基因cpcs,cpct,cpcu的克隆及在有光学活性藻蓝蛋白β亚基生物合成中的功能分析-cloning of arthrospira chromolyase gene cpcs, cpct and cpcu and functional analysis in biosynthesis of optically active phycocyanin β subunit.docx

独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者也}ι冉一签字日期:树今年E月μ日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下事项:1、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。2、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学中国学术期刊(光盘版)电子杂志社用于出版和编入CNKI((中国知识资源总库))，授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。〈保密的学位论文在解密后适用本授权书〉学位论文作者签名:以牛导师签字:拟必伺签字日期:tvl吁年5月]，1.-日签字日期:年月日万方数据节旋藻色基裂合酶基因cpcS，cpcT，cpcU的克隆及在有光学活性藻蓝蛋白β亚基生物合成中的功能研究摘要钝顶节旋藻(Arthrospiraplatensis)是一种具有很高营养价值的经济微藻，其富含藻蓝蛋白，藻蓝蛋白具有抗氧化，抗肿瘤等作用，还可作为一种天然色素，广泛用于医药、食品、化妆等行业，此外由于其所特有的荧光活性且无毒，还可用作荧光标记物及光动力治疗等领域。近年来，通过基因工程手段表达具有光学活性藻蓝蛋白研究取得了较多的成果，为有光学活性藻蓝蛋白的应用及构建新的光合系统提供了基础。光学活性藻蓝蛋白的合成过程中重要的一步是藻蓝胆素与脱辅基蛋白的共价偶联，而藻蓝胆素与脱辅基蛋白的正确连接需要特定的色基裂合酶的催化。光学活性藻胆蛋白的生物合成一般需要脱辅基藻蓝蛋白（CpcA,CpcB），色基合成酶（Hox1,PcyA），色基裂合酶三种元件的共同参与。本实验室前期关于节旋藻藻蓝蛋白α亚基的色基裂合酶的研究已经比较完整，但是还没有关于节旋藻藻蓝蛋白β亚基色基裂合酶的研究，因此本论文克隆了节旋藻藻蓝蛋白β亚基的色基裂合酶，并研究了其功能。本论文首次克隆了钝顶节旋藻A.platensisFACHB314的色基裂合酶基因cpcS，cpcT和cpcU，其中cpcS全长594bp，编码197个氨基酸序列，分子量为22.1kDa，blastp比对其属于CpeSsuperfamily，存在5个保守结构域，分别是THHL，ENH，LRERGYAEI，YETM和ERF，氨基酸序列的同源比对结果显示与其他蓝藻的序列相似度为72.52%；cpcT基因全长597bp，编码198个氨基酸残基，等电点为5.29，分子量为22.8kDa，blastp比对其属于CpeTsuperfamily，具有FSN，NPP，AHI，RPL，EQAY，PYR和FKG七个保守结构域，氨基酸序列的同源比对结果显示与其他蓝藻的序列相似度为71.14%；cpcU基因全长525bp，编码174个氨基酸残基，等电点为5.30，分子量为19.2kDa，blastp比对其属于CpeSsuperfamily，具有7个保守域，分别是EFF，SAGKWFS，GKS，EER，PNLR，ASF和SEIR，氨基酸序列的同源比对结果显示与其他蓝藻的序列相似度为73.22%。为了研究节旋藻的色基裂合酶CpcS，CpcT和CpcU在藻蓝蛋白β亚基与藻蓝胆素结合过程的作用，本实验构建了3个重组表达载体：pACYCDuet-cpcB-cpcS（含有藻蓝蛋白β亚基基因cpcB和色基裂合酶cpcS基因），pACYCDuet-cpcB-cpcT（含有藻蓝蛋白β亚基基因cpcB和色基裂合酶cpcT基因）和pACYCDuet-cpcB-cpcU（含有藻蓝蛋白β亚基基因cpcB和色基裂合酶cpcU基因），并将这3个载体和pACYCDuet-cpcB（仅含有藻蓝蛋白β亚基基因cpcB）分别与pET24-hox1-pcyA（含有色基合成酶hox1和pcyA基因）一起转入大肠杆菌BL21中，构建重组表达菌株BS，BT，BU和B，并诱导蛋白表达，SDS和WesternBlotting检测蛋白的表达情况，荧光光谱检测重组蛋白的荧光强度，结果显示重组菌株中均表达出了藻蓝蛋白，而且有色基裂合酶存在的菌株比没有色基裂合酶的菌株表达的藻蓝蛋白的荧光强度高，而且荧光发射峰更接近天然藻蓝蛋白，说明色基裂合酶对光学活性藻蓝蛋白β亚基的合成具有一定的催化作用。为了进一步研究这三个色基裂合酶在藻蓝蛋白β亚基上的作用位点，通过将节旋藻藻蓝蛋白β亚基82位和153位的半胱氨酸分别进行突变，突变成丙氨酸，构建突变菌株B(C