结核分枝杆菌小分子热休克蛋白hsp的表达 纯化和鉴定-expression, purification and identification of small molecule heat shock protein hsp in mycobacterium tuberculosis.docx

结核分枝杆菌小分子热休克蛋白 结核分枝杆菌小分子热休克蛋白 Hsp16.3 的表达、纯化和鉴定 PAGE PAGE 5 摘 要 目的：构建结核分枝杆菌小分子热休克蛋白 Hsp16.3 原核表达载体，获得 Hsp16.3 蛋白，并应用生 物信息学技术对结核分枝杆菌小分子热休克蛋白 Hsp16.3 进行分析，获取该基因的相关信息。 方法：以结核分枝杆菌 H37Rv 株基因组 DNA 为模板，应用 PCR 方法扩增 Hsp16.3 基因，以 PET28a 质粒为载体，构建重组质粒 PET28a- Hsp16.3，测序正确后，转入宿主菌 BL21（DE3）进行诱导表 达。表达的融合蛋白经 SDS，Western Blot 分析鉴定，并通过镍柱进行亲和层析纯化，表达蛋 白分子质量约 17 kD 能被结核杆菌 16 kD 单克隆抗体和小鼠抗 His Tag 单克隆抗体识别。利用 Pmtparam， Protseale，HMMTOP， TMHMM ，GOR4，ProtFun 等软件，进行生物信息学分析结 核分枝杆菌小分子热休克蛋白 16.3 的氨基酸组成、理论等电点、结构域、疏水性、跨膜区、糖基化 位点、磷酸化位点及二级结构等。 结果：成功构建了 Hsp16.3 原核表达载体 PET28a- Hsp16.3，并在宿主菌 BL21（DE3）中表达。生物 信息学分析结核分枝杆菌小分子热休克蛋白 16.3 白分子式为：C716H1131N197O225S4，分子量为 16227.2， 理论等电点为 5.00。该蛋白氨基酸序列中含有α-螺旋(Alpha helix) 46 处，延伸链(Extended strand) 25 处，无规则卷曲(Random coil)73 处及 5 个磷酸化位点；4 个 O-糖基化位点；1 个前肽裂解预测位点； 该蛋白是一个亲水性不稳定蛋白，无跨膜区，可能参与重要的能量代谢及免疫反应。 结论：1.Hsp16.3 基因克隆入宿主菌中并成功表达。 2. 经过纯化得到纯度较高的目的蛋白，为 Hsp16.3 的进一步研究奠定基础。 3. 生物信息学分析显示该蛋白是一个亲水性不稳定蛋白，无跨膜区，可能参与重要的能量代谢及免 疫反应。 关键词：结核分枝杆菌，Hsp16.3，蛋白表达，纯化，生物信息学 论文类型：A（基础研究） Abstract Objective: To construct small heat shock protein 16.3 prokaryotic expression vector of Mycobacterium tuberculosis, and obtain information of Mycobacterium tuberculosis small heat shock protein 16.3，the character of this gene and its product protein were analyzed by a series of bioinformatics technology. Methods: The Hsp16.3 gene was amplified from M.tuberculosis H37Rv genomic DNA by PCR. The PCR products were further inserted into plasmid PET28a to construct the recombinant plasmid PET28a-Hsp16.3, after sequencing, the recombinant plasmid PET28a-Hsp16.3 was transformed into E.coli BL21 (DE3) for expression. Then the fusion protein of Hsp16.3 was identified by SDS、Western-blot, and purified by Ni-NTA system. The protein molecular weight is about 17 kD, it can be recognized by 16 kD mAb of Mycobacterium tuberculosis and mouse against anti-His Tag mAb. Bioinformatics analysis of Mycobacterium tuberculosis small heat shock protein 16.3’s amino acid composition，equipotential， domain，hydrop