实时定量PCR技术知识的原理及应用 生命科学前沿 .pptVIP

实时定量PCR技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR);;;实时定量PCR 原理 实时原理 ;介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值;阈值：在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上 设定的荧光检出界限;实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值;; SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。;;;;;;定量PCR仪光学原理;;Ct值的重现性;定量原理;标准曲线;确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量;;非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon 4、Amplisensor;;SYBR Green 法 工作机理;实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 工作原理;荧光染料嵌合法(SYBR Green I)作用机理示意图;;SYBR Green 法 融解曲线分析;;利用SYBR Green 法定量检测样品DNA;SYBR Green 法优缺点 ;与目标序列互补;TaqMan法工作原理;TaqMan法优缺点; Real Time 将进入SYBR Green I 时代;;;;;数据分析;已肝病人血液中HBV的绝对定量 目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据 方法：从血液中提取病毒DNA，扩增病毒基因，以TaqMan探针进行检测 设置对照：浓度为106、105 、104 103 的标准样品各一个，设阴性和空白对照 实验步骤：提取HBV DNA 设计特异引物 设计TaqMan探针并标记探针 扩增程序 结果：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数;