裂殖酵母中细胞端部定位的dma1通过调节tip1clip170的泛素化修饰来调控细胞的极性生长-dma 1 located at the end of cells in schizosaccharomyces cerevisiae regulates the polar growth of cells by regulating the ubiquitination modification of tip 1 clip 170..docxVIP

目录1．7主要仪器及设备．261．8常用培养基、主要缓冲溶液的配制．272方法342．1裂殖酵母菌株的构建．342．2裂殖酵母基因组提取—破碎法．362．3裂殖酵母转化．362．4质粒DNA的制备．．372．5琼脂糖胶回收DNA片段．．382．6PCR产物纯化回收392．7大肠杆菌感受态细胞的制备．392．8质粒DNA的细菌转化．．402．9常规PCR．．402．10定点诱变PCR一412．11DNA限制性内切酶酶切反应．412．12DNA连接．422．13带有6HA标签，同时带有点突变的唧l突变体的构建422．14有关带有基因型tipl．6HA的菌株的实验处理．432．15蛋白体外结合(havitropull—down)432．16免疫共沉淀(co．口1一442．17免疫印迹检测(Westernblot)442．18酵母细胞Calcofluor染色44第三章实验结果和分析461影响Dmal在细胞端部定位的因子的筛查．462Dmal与Tipl的相互作用依赖于Dmal的FHA结构域513细胞末端定位的Dmal通过泛素化Tipl来调控细胞的极性生长533．1强制增加Tipl在细胞端部的定位会造成细胞极性生长缺陷533．2增加Dmal在细胞端部的定位可以抑制由于端部郦l的增加所造成的极Ⅱ万方数据目录性生长缺陷554Tipl的磷酸化可能是其泛素化的前提．574．1Tipl中的T299和$302位点的磷酸化影响Tipl的泛素化修饰574．2CKl激酶nhp2影响Tipl的泛素化修饰604．3hhp2≠缺失后细胞端部的Tipl增加，细胞呈现极性生长缺陷．615去除Tipl的泛素化对细胞极性生长的影响．625．1所有25个赖氨酸全部突变的Tipl不再被泛素化．．625．2第244位的赖氨酸(K244)是砷l连接泛素的位点之一645．3不能被泛素化的Tipl导致细胞端部Tipl增加和极性生长缺陷．．646Tipl的泛素化修饰对其蛋白水平的影响。65第四章讨论．67参考文献70附录75致谢。78Ⅲ万方数据ContentsAbbreviations．．．．．．。。。．．。．．．．．．．．．。．．。。。。。。．．．．．。．．VIIChinaseabstract。。．。。．。。．．．．。．。。。．．。。．．。。．．．。。。。。．．。。．．．。。．。。．．。IXAbstract．。。。．。。．．。。．。。。．。。。。。。。。。。．。。。。。．。．。。。。．．。．。。．ⅪChapter1Introduction．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．11RhofamilyGTPaseCdc42anditsregulatorsinpolarizedgrowthcontrol22Theroleofcellcytoskeletoninregulatingpolarizedgrowth一42．1Microtubulecytoskeletonandcellpolarity·42．2Actincytoskeletonandcellpolarity··73Exocytosisandendocytosisincellpolaritycontrol84Themleofotherfactorsinregulatingpolarizedgrowth·95ThemultiplefunctionsofDmalandpotentialconnectionbetweenDmalandpolarityfactorTiplinfissionyeast·105．1ThemultiplefunctionsofDmalinfissionyeast．．105．2PotentjalconnectionbetweenDmalandpolarityfactorTplinfissionyeast．．．．．．．．．．．．．．．．．．．116Purpose，contentsandsignificanceofthisstudy”12Chapter2Materialsandmethods．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．131Materials131．1Bacteriumstrains131．2Yeasts廿aills．．131．3Plasmids．191．4Primers211．5Moleculartoolenzymes．25Ⅳ万方数据Contents1．6Reagents．．．．．．．．．．251．7Maininstruments．．．．．．．．．．．261．8Solutionsandbuffers．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．272Methods．．342．1Constructionofyeaststrains342．2Fission