类固醇激素受体辅激活因子1通过增强wntβ-catenin信号通路促进肝癌发展-steroid hormone receptor coactivator 1 promotes the development of liver cancer by enhancing wnt β - catenin signaling pathway.docxVIP

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2018-05-29 发布于上海
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类固醇激素受体辅激活因子1通过增强wntβ-catenin信号通路促进肝癌发展-steroid hormone receptor coactivator 1 promotes the development of liver cancer by enhancing wnt β - catenin signaling pathway.docx

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类固醇激素受体辅激活因子1通过增强wntβ-catenin信号通路促进肝癌发展-steroid hormone receptor coactivator 1 promotes the development of liver cancer by enhancing wnt β - catenin signaling pathway

目录1．4．1c-Myc蛋白结构251．4．2c．Myc的调控261．4．3c-Myc的生物学功能271．4．3．1c．Myc在细胞周期中的调控作用271．4．3．2c．Myc在细胞增殖中的作用281．4．3．3c．MVc在细胞凋亡中的作用281．4．3．4c．Myc在代谢中的作用291．4．3．5c．Myc与肿瘤和其他疾病291．5立题背景、内容和意义30第二章材料与方法．321材料321．1细胞株．321．2质粒载体及菌株．321．3siRNA．321．4实验小鼠331．5主要试剂331．6主要仪器．352实验方法．362．1分子克隆362．1．1大肠杆菌感受态制备(以DH5a为例)．．362，1。2质粒转化感受态细胞．．372．1．3质粒的构建．．382．1．3．1引物设计．382．1．3．2PCR过程．．382．1．3．3双酶切．392．1．3．4DNA胶回收392．I．3．5载体与克隆片段的连接．402．1．3．6小量提取质粒DNA402．1．3．7中量提取质粒DNA412．2RNA相关实验及方法．．422．2．1RNA的提取．422．2．2反转录合成cDNA一422．2．3实时荧光定量PCR．432．3蛋白质相关实验与方法．432．3．1蛋白样品的制备．．432．3．2蛋白浓度测定．．442．3．3SDS．PAGE电泳以及WesternBlot分析442．3．4GST融合蛋白的诱导．．452．3。5GST沉淀实验(GST-pulldownassay)．462．3．6免疫共沉淀实验(Co．IP)472．4细胞相关实验及方法48万方数据I：j录2．4．1细胞培养及传代．．482．4．2肝癌细胞瞬时转染及稳定转染一482．4．3细胞siRNA转染492．3．4CaCl2转染HEK293T细胞．．502．3．5细胞荧光素酶活性检测．．5l2．4．6M1vr测细胞生长．522．4．7EdU染色检测增殖细胞．．522．4．8克隆形成实验．．532．4．9利用流式细胞仪检测细胞周期．．532．4．10利用流式细胞仪检测细胞存活率532．5小鼠相关实验及方法542．5．1小鼠尾部基因组的提取．．542．5．2SRC．1基因敲除小鼠的鉴定542．53裸鼠移植瘤实验．．552．5．4DEN／CCl4诱导小鼠原发性肝癌模型．562．5．5LiCI激活小鼠正常肝细胞的模型．．562．5．6HE染色572．5．7Ki．67组化染色57第三章结果与分析．．593．1SRC．1在人肝癌样晶中广泛过表达并与PCNA呈正相关．593．1．1SRC．1在肝癌组织中广泛过表达593．1．2SRC．1阴性的肝癌组织样品中PCNA的表达量显著降低．．6l3．13SRC．1的表达量与PCNA呈显著正相关关系．．623．2下调SRC．1显著抑制肝癌细胞的增殖633．2。1SRC．1在肝癌细胞系中过表达633．2．2siRNA敲低SRC—l在肝癌细胞系中表达．．633．2．3瞬时敲低SRC一1显著抑制肝癌细胞系的增殖．643．2．4稳定敲低SRC．1显著抑制HepG2细胞的增殖653．2，5稳定敲低SRC．1显著}Ip,JJHepG2细胞的克隆形成673．3下调SRC．1显著抑制c．Myc的表达683t3．1稳定敲低SRC．1阻抑细胞周期进程．683．3．2稳定敲低SRC．1抑制增殖细胞的数量．683．3．3SRC．1正向调节c．Myc的表达．．693．3。4瞬时敲低c．Myc显著抑制HepG2细胞的增殖703．3．5瞬时敲低c．Myc抑制增殖细胞的数目．7l3．3，6在SRC一1敲低的细胞株中回补c—Myc能恢复肝癌细胞增殖723。3。7SRC．1阳性肝癌样本中c．Myc的mRNA水平显著升高．723．4SRC．1协同Ij-catenin促进c-Myc的表达．733．4．1SRC．1协同13-catenin增强c—Myc启动子活性．733．4。2SRC．1增强13-catenin的转录活性．．743．4．3下调SRC，1抑制[3-catenin诱导的c．Myc的表达753．4．4SRC．1乒小鼠中LiCl激活的c．MyC表达量显著降低763．4。5SRC．1与13-catenin相互结合。．76Ill万方数据目录3．4．6SRC．1与p-catenin直接结合．．783．4．7SRC．1与13-catenin的Arm3．10区域结合．783．4．8SRC。1的bHLH—S／T和HAT片段与fl-catenin结合．793．5下调SRC．1抑制肝癌细胞移檀瘤的维持．803．5．1下调SRC一1}印制肝癌细胞移植瘤的生长．803．5．2下调SRC．1}【p制肝癌细胞移植瘤的大小．．803．5．3SRC一1敲低的肿瘤中增殖细胞数量显著低于对照组肿瘤813．5．4SR