抗citrullinecarbamylation抗体的制备及其elisa检测方法的初步建立-preparation of anti - citrinecarboxylation antibody and preliminary establishment of its elisa detection method.docxVIP

重庆理工大学 学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。 除文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成 果、作品。对本文的研究做出重要贡献的集体和个人，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律后果。作者签名：日期：年月日学位论文使用授权声明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权重庆理工大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于（请在以下相应方框内打“√”）：1.保密□，在年解密后适用本授权书。2.不保密□。作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日中文摘要在 mRNA 翻译成为蛋白质之后，有时会共价修饰某些蛋白质上的特定氨基 酸残基，该过程被称为蛋白质翻译后修饰(PTM)。其中磷酸化、糖基化、瓜氨酸 化、糖化、羟基化和泛素化较为常见。不同的修饰方式涉及不同的氨基酸，存在 于不同的疾病生理病理过程，它们常常伴随多种自身免疫性疾病(AID)的发生。 瓜氨酸化(Citrullination)是一种酶介导的 PTM 方式。它是在 Ca2+的参与和肽 酰基精氨酸脱亚氨酶(PAD)催化作用下把精氨酸(Arg)残基的胍基转变成脲基，生成瓜氨酸(Cit)残基。以前通常认为瓜氨酸化是类风湿性关节炎（RA）所特异的。 但是随着研究地不断深入，在牛皮癣、多发性硬化症、纤维化、老年痴呆症和肿 瘤等疾病中也发现了瓜氨酸化。氨甲酰化(Carbamylation/Homocitrullination)的具体过程是蛋白质的赖氨酸残 基在尿素的衍生物—氰酸酯的作用下转变成高瓜氨酸(Hcit)残基，常存在于尿毒 症、肾衰竭、动脉粥样硬化和冠状动脉疾病等症状中。本文展开了对瓜氨酸化和氨甲酰化的研究，半抗原的设计与合成，制备抗 Citrulline 抗体和抗 Carbamylation 抗体，着力于 ELISA 检测方法的建立。主要研 究结果如下：（1）Citrulline 半抗原的设计借鉴了氨基脲（SEM）、呋喃唑酮代谢物（AOZ）、 福美双（Thiram）和磷酸化酪氨酸半抗原设计的方法，增加了半抗原的复杂性， 设计并合成了 Citrulline 人工抗原。同时参照文献也合成了 Carbamylation 人工抗 原。BCA 法测定了 5 个免疫原和 3 个包被原的浓度，SDS法鉴定了人工 抗原。（2）免疫大白兔和小鼠后，检测到了抗 Citrulline 抗体和抗 Carbamylation 抗体。抗 Cit-G-BSA 兔子抗血清效价效价均大于 3.2×104，抗体特性同商品化的 多抗。抗 cBSA/cKLH 小鼠抗血清效价效价均大于 6.4×104。（3）取目的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，经 3 轮细胞亚克隆操 作后，建立起了 4 个抗氨甲酰化蛋白细胞株，分别命名为 13C11-F12-H2-F4、 14E5-E8-G3-D8、14E10-F6-F7-E5 和 10E3-F9-G5-D8。（4）通过动物体内诱生法和蛋白 A 亲和层析获得了 2 个抗 Carbamylation 单克隆抗体，命名为 mAb-13C11 和 mAb-10E3，效价均大于 3.14×106，亚类均为 IgG2b，都特异性地识别氨甲酰化的蛋白质，不识别正常蛋白。（5）引入双抗夹心法和生物素-亲和素系统，利用 mAb-13C11 建立起了ELISA 检测方法，确定最佳条件为：mAb-13C11 20μg/mL、1% BSA、Bio-13C113μg/mL、SA-HRP 12.5ng/mL 和 TMB 20min。对氨甲酰化蛋白的检测已达到 ng级别。成功地检测到冠状动脉粥样硬化性心脏病、动脉粥样硬化心肌梗塞和关节 炎病人滑液疾病样本中氨甲酰化蛋白的含量与对照组有显著差异。本文初步探索了 citrulline 半抗原的设计，同时为氨甲酰化蛋白质检测试剂 盒（Sandwich ELISA）和特定疾病检测试剂盒（Sandwich ELISA）的研制奠定了 基础。关键词：蛋白质翻译后修饰；瓜氨酸化；氨甲酰化；酶联免疫吸附测定；双抗夹 心法；生物素-亲和素系统AbstractPost-translational modification is a covalent process which changes the properties of a protein by proteolytic cleavage or by addition of a modifying group to on