抗hiv-anti - hiv.docxVIP

中文摘要抗日IV-l 核心抗原 P24 单克隆抗体的 制备及初步应用摘要 目的:制备稳定产抗四V幽 1核心抗原 P24(HIV幡 lP24 费简称凹的单克隆抗体〈简称单抗〉的杂交瘤细胞株?纯化单抗 9筛选具备不同抗原结合位点的单抗 F用于 探索构建检测 P24 的 ELISA 法。方法:基因重组 p24 抗原免疫 BALB/c 小鼠 5 次。取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞 SP2/0 ，用PEG融合， HAT 选择培养?间接 ELISA法筛选分泌抗 P24 抗体阳性的杂 交瘤细胞?克隆化培养得稳定分泌抗 P24 单抗的杂交瘤细 胞株。杂交瘤细胞株细胞注入 BALB/c 小鼠腹腔?每只注 射1.5x 106 个细胞，制备腹水，得腹水型单抗:杂交瘤细 胞株细胞悬于完全培养液内培养费长满后取上、清?得上清 型单抗:杂交瘤细胞株细胞用无血清1640 液培养，待细 胞充分生长后收集上清费得无血清单抗 F用于抗体 Ig类 别的测定。用间接 ELISA 法测定单抗效价和 Ig 类别。腹 水型单抗作热稳定性及耐冻融性实验。热稳定性实验为腹 水 370C 保存 1-7 天或 40C保存 7 天后测效价:耐冻融性实验为腹水于-200C 冻实后室温自然融化?反复 6 次后测效 价。从腹水纯化单抗的方法是:腹水依次用 50%、30%、 30%饱和硫酸胶 (SAS) 沉淀后 40C 透析过夜得 SAS 粗提 单抗蛋白。取 SAS 粗提单抗蛋白上 P24 抗原做配体的滨化 氨活化的 Sepharose 4B 亲和层祈柱，用 O. OlM PH7. 4 PBS液(含 0.5 M Nacl) 洗脱杂蛋白，再用 3M PH6. 1 硫氨酸饵液洗脱收集特异性单抗组分，然后对 o. 01M PH 7.4 PBS充分透析得纯化的单抗。纯化的单抗用 SDS测定纯 度。纯化的单抗用 HRP标记，并用间接 ELISA法测定 效价。用交互竞争抑制实验筛选具备不同抗原结合位点的 单抗，方法是:确定标记单抗和未标记单抗同 P24 抗原反 应的饱和浓度。根据此结果，单抗两两配对测定抑制率， 根据抑制率确定哪两种单抗之间具备不同的抗原结合位 点。选用具备不同抗原结合位点的两单抗，按不同的方式 组合，建立检测 P24的 ELISA 法试剂体系，进而筛选确 立灵敏度高的检测体系。第一种组合是单抗·单抗夹心的 ELISA 法;第二种组合是单抗-兔多抗夹心的 ELISA 法: 第三种组合是单抗-进口多抗夹心的 ELISA 法:第四种组 合是双单抗-兔多抗夹心的 ELISA 法:第五种组合是双单 抗·进口多抗夹心的 ELISA 法。初步应用上述五种组合检 测体系测定不同稀释浓度的 P24 抗原，确定各自的检测灵 敏度，同时用 HIVgp41 、gp120 、gp36 抗原和HbsAg 阳性 血清，测定上述五种不同组合 ELISA法检测 P24的特异 性。结果:共获得 5 株稳定分泌抗 P24单抗的杂交瘤细胞株，分别命名为 12帽 At 、2-E4 、 12-F9 、3-H 8夕-A7，它们分泌的单抗 Ig 类别分别是: 2-E4 为 IgG2a，12- AI 为 IgG2b ， 其余为 IgMo 2-E4 和 12-A1 腹水效价分别为 1: 640 万和 1: 320 万。取杂交瘤细胞株 2-E4 腹水鉴定单抗的热稳性及耐 冻融性。结果发现，在 4 0C 放置一周，效价没有改变;37℃放置 2 天后效价下降一个稀释度(至 1:320 万)，至第5 天，又下降一个稀释度(至 1:160 万)，至第 7 天，下降至 1: 800000; 在-20 0C冻存可长期保持抗体效价不变。 将 2-E4 和 12-A1 腹水经饱和硫酸肢沉淀粗提后上免疫亲和 层析柱，分别用不同的洗脱液洗脱，收集到两个峰的组分。第一个峰为杂蛋白组分，第二个峰为特异性单抗组分。经 SDS电泳鉴定，从电泳图谱中可见:饱和硫酸胶沉 淀粗提的蛋白不纯，而免疫亲和层析纯化的第二峰单抗蛋 白很纯，仅在相对分子量为 170KD 的蛋白位置有一条带 o HRP标记的 2-E4 单抗和 12-A1 单抗， ELISA 测定效价分 别为 1:40000 (1:1000 应用)和 1:5000 (1:2000 应用)。用交互竞争抑制实验筛选具备不同结合位点的单抗， 12-A1 和2-E4 相互抑制率 300/0 ，二者为针对不同抗原结合位点的 单抗。选用具备不同抗原结合位点的 12-A1 和 2-E4 ，建立 五种检测 HIV-1 P24 抗原的 ELISA 法试剂体系并初步应 用发现，不同试剂体系检测P24的灵敏度差异很大，从 lng/ml-12.Spglmlo经过筛选确定使用 12-A1 和 2-E4