抗黄曲霉毒素b1单克隆抗体制备及其性质鉴定-preparation and characterization of monoclonal antibody against aflatoxin b1.docxVIP

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  • 2018-05-29 发布于上海
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抗黄曲霉毒素b1单克隆抗体制备及其性质鉴定-preparation and characterization of monoclonal antibody against aflatoxin b1.docx

抗黄曲霉毒素b1单克隆抗体制备及其性质鉴定-preparation and characterization of monoclonal antibody against aflatoxin b1

独创性声明本人声明,所呈交的学位(毕业)论文,是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果,并且是自己撰写的。尽我所知,除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外,论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志,都在论文中作了明确的说明并表示了谢意,如被查有侵犯他人知识产权的行为,由本人承担应有的责任。学位(毕业)论文作者亲笔签名:日期:论文使用授权的说明本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位(毕业)论文的规定,即学校有权送交论文的复印件,允许论文被查阅和借阅;学校可以公布论文的全部或部分内容,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。保密,在年后解密可适用本授权书。□不保密,本论文属于不保密。□学位(毕业)论文作者亲笔签名:日期:指导教师亲笔签名:日期:目录目录i摘要IAbstractII第一章文献综述11.1黄曲霉毒素简介11.1.1黄曲霉毒素来源及分布11.1.2黄曲霉毒素种类及其结构12.1引言152.1.1小分子半抗原和载体蛋白152.1.2完全抗原的合成原理152.1.3完全抗原的合成方法碳二亚胺法戊二醛法氯甲酸异丁酯法重氮法172.1.4本章研究的主要目的和主要内容172.2材料和方法182.2.1实验材料182.2.2实验仪器182.2.3实验方法AFB1两种完全抗原的合成AFB1多抗血清的制备202.3结果和讨论22AFB1肟的制备22AFB1-BSA偶联物的鉴定紫外扫描鉴定红外扫描鉴定iELISA鉴定偶联结果252.4本章小结27第三章AFB1单克隆抗体的筛选及鉴定283.1引言283.1.1单克隆抗体理论基础283.1.2分泌特异性抗体的杂交瘤单克隆细胞的流程283.1.3本章研究内容及目的和意义303.2材料和方法303.2.1实验材料303.2.2实验仪器313.2.3实验方法3实验动物的选择3小鼠免疫3血清效价的测定3最佳包被抗原稀释度的测定3一抗最佳稀释液的选择3最佳包被抗原浓度的测定3二抗最佳工作浓度的测定3标准竞争曲线的绘制3实际样品前处理30加标样品回收率和变异系数的测定31细胞融合32阳性杂交瘤细胞的筛选33杂交瘤细胞的亚克隆和扩大培养34细胞染色体的观察35抗AFB1单克隆抗体特性鉴定363.2.4实验结果3血清效价的测定3一抗最佳稀释液的选择3最佳包被抗原稀释度的测定40最佳包被抗原蛋白浓度的测定4二抗最佳工作浓度的测定4标准竞争曲线的绘制4加标样品回收率和变异系数的测定4融合前细胞观察4融合后细胞观察4阳性杂交瘤细胞的筛选4杂交瘤细胞的亚克隆和扩大培养40细胞染色体的观察41抗体亚型鉴定42腹水制备43单克隆抗体的纯化44抗AFB1单克隆抗体与其它毒素的交叉反应505抗AFB1单克隆抗体亲和力的测定503.3讨论513.3.1完全抗原的制备513.3.2SP2/0骨髓瘤细胞的复苏和冻存513.3.3细胞融合513.3.4单克隆筛选513.3.5免疫方法513.3.6抗体纯化52全文总结53参考文献54致谢59附录60摘要黄曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)主要是由黄曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)产生的毒性极强的次生代谢产物,黄曲霉毒素是一类结构类似的化合物的总称。在黄曲霉毒素家族中,常见的有黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1和M2等。早在1988年黄曲霉毒素B1被国际肿瘤研究机构(IARC)定为一级致癌物。传统的检测方法不但耗时耗力,成本偏高,而且还需要专业技术人员对分析仪器进行操作。采用免疫化学分析法进行检测则可以克服以上缺点。本文旨在筛选出能分泌抗AFB1的高亲和力的单克隆抗体细胞株,为建立免疫化学检测方法打下基础。首先用碳二亚胺法(EDC)构建了两种完全抗原AFB1-BSA和AFB1-OVA,其中AFB1-BSA作为免疫原免疫两只8周龄BALB/C雌性小鼠四次,AFB1-OVA作为包被原包被酶标板,iELISA法测定免疫小鼠血清效价。加强免疫后,两只小鼠的效价分别达到了128000和32000。采用PEG(4000)法将SP2/0骨髓瘤细胞和免疫小鼠脾脏细胞进行融合,HAT筛选培养基筛选培养,经过3~4轮筛选得到三株能稳定分泌抗AFB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株:1B7、5A8、5B8。其中,1B7和5A8细胞株分泌的单克隆抗体为IgM亚型,5B8细胞株分泌的抗体为IgG1亚型。为便于后期纯化,本次实验采用5B8细胞株进行后续实验。经测定,5B8细胞株分泌的单克隆抗体效价达到20,0000,亲和力为7.96×108。将该细胞株进行扩大培养并注射到13周龄雌性Balb/c小鼠腹腔中,一周后取腹水,采用辛酸-硫酸铵法纯化腹水,经SDS检测可以看到明显的重链和轻链条带,证明单克隆抗

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