抗淋病ltbporb核酸疫苗与重组蛋白疫苗联合免疫的免疫增强效应研究-study on immune enhancement effect of nucleic acid vaccine against gonorrhoea ltbporb combined with recombinant protein vaccine.docx

目 录 中文摘要1 英文摘要3 前言6 实验材料9 实验方法11 实验结果26 讨论46 结论51 参考文献52 英文缩略语索引56 文献综述58 发表及及待发表论文65 致谢66 PAGE PAGE 10 抗淋病 LTB-porB 核酸疫苗与重组蛋白疫苗 联合免疫的免疫增强效应研究 硕士研究生： 戴志兵 导 师： 胡四海 教授 中 文 摘 要 目的： 将 LTB-PorB 核酸疫苗和重组蛋白疫苗鼻饲免疫 BALB/c 小鼠，分别分析其免疫 活性，探讨粘膜佐剂 LTB 能否辅佐 PorB 诱导更有效的特异性粘膜免疫，为经粘膜途 径感染病原体的疫苗研制进行有益探索；采用抗淋病 LTB-PorB 核酸疫苗与重组蛋白 疫苗联合（核酸初免-蛋白加强免疫）鼻饲免疫雌性 BALB/c 小鼠，探讨其能否增强 特异性体液免疫和细胞免疫应答水平，为研制高效抗淋病疫苗提供实验依据。 方法： 1. 对本课题组保存的真核表达重组质粒 pcDNA3.1(-)/ltB、pcDNA3.1(-)/porB 和 pcDNA3.1(-)/ltB-porB 进行鉴定后，大量制备并纯化；鼻饲免疫雌性 BALB/c 小鼠， 检测体液免疫和细胞免疫水平。 2. 将 本 课 题 组 保 存 的 原 核 表 达 重 组 质 粒 pET-30a/ltB 、 pET-30a/porB 和 pET-30a/ltB-porB 在大肠杆菌 BL21 中诱导表达重组蛋白；鼻饲途径免疫雌性 BALB/c 小鼠，检测体液免疫和细胞免疫水平。 3. 大量制备 LTB-PorB 核酸疫苗及重组蛋白疫苗；通过鼻饲途径将核酸疫苗和重 组蛋白疫苗采用核酸初免-蛋白加强（DNA prime-protein boost）联合免疫雌性 BALB/c 小鼠，检测体液免疫和细胞免疫应答水平。 结果： 1. LTB-PorB 核酸疫苗（pcDNA3.1(-)/ltB-porB）免疫组小鼠生殖道黏膜产生的 PorB 特异性 sIgA 和血清 IgG 水平随免疫时间呈上升趋势，第 8 w sIgA A450 值达 0.470±0.088 ， 明 显 高 于 对 照 组 （P0.01 ）， 效 价 达 1 ： 320 ； 第 8 w IgG A450 值 为 0.528±0.106，明显高于 pcDNA3.1(-)/ltB、pcDNA3.1(-)和 PBS 对照组（P0.01），效 价达 1：1280，但与 pcDNA3.1(-)/porB 对照组（A450：0.511±0.094）无显著性差异 （P0.05）。pcDNA3.1(-)/ltB-porB 组脾淋巴细胞刺激指数和脾淋巴细胞诱生的 IFN-γ、 IL-4 水平均明显高于 pcDNA3.1(-)/ltB、pcDNA3.1(-)和 PBS 对照组（P0.05）。 2. LTB-PorB 重组蛋白疫苗免疫组小鼠生殖道黏膜产生的 PorB 特异性 sIgA 水平 随免疫时间呈上升趋势，第 6 w A450 值达 0.663±0.095，明显高于对照组（P0.01）， 效价达 1：1280；血清中 PorB 特异性 IgG 水平在第 4 w 达最高，A450 值为 0.598±0.062， 明显高于 LTB 和蛋白溶解液（Solution Buffer）对照组（P0.01），效价达 1：5120， 但与 PorB 对照组（A450：0.570±0.060）无显著性差异（P0.05）。LTB-PorB 组脾淋巴 细胞诱生的 IL-4 水平和脾淋巴细胞刺激指数明显高于 LTB 和 Solution Buffer 对照组 （P0.05），但脾淋巴细胞诱生的 IFN-γ水平与对照组无显著性差异（P0.05）。 3. LTB-PorB 核酸疫苗和重组蛋白疫苗联合免疫组免疫后第 8 w，小鼠生殖道 sIgA （A450：1.083±0.179，效价达 1：2560）、血清 IgG （A450：1.023±0.116，效价达 1： 20480）、脾淋巴细胞诱生的 IL-4（357.58±34.44 pg/ml）和 IFN-γ（261.85±29.92 pg/ml） 水平均明显高于对照组（P0.01），小鼠脾淋巴细胞刺激指数（SI：2.12±0.29）较对 照组显著增高（P0.05）；核酸疫苗组、蛋白疫苗组和联合免疫组血清 IgG 亚类 IgG2a/IgG1 比值分别为 1.678、0.455 和 0.693。 结论： 1. LTB-PorB 核酸疫苗和重组蛋白疫苗通过鼻饲免疫雌性 BALB/c 小鼠，能诱生较 高水平的特异性细胞免疫和体液免疫，尤其是粘膜免疫，表明粘膜佐剂 LTB 可有效提 高 PorB 诱导的特异性粘膜免疫应答水平。 2. LTB-PorB