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利用ledgfp75蛋白构建hiv-construction of hiv with led gfp75 protein
南开大学学位论文原创性声明本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师指导下进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外,本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。学位论文作者签名:张单单2015年05月21日非公开学位论文标注说明(本页表中填写内容须打印)根据南开大学有关规定,非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申请和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文,公开学位论文本说明为空白。论文题目申请密级□限制(≤2年)□秘密(≤10年)□机密(≤20年)保密期限20年月日至20年月日审批表编号批准日期20年月日南开大学学位评定委员会办公室盖章(有效)注:限制★2年(可少于2年);秘密★10年(可少于10年);机密★20年(可少于20年)摘要HIV-1整合酶(IN)是HIV-1生命周期中必不可少的三大关键酶之一。在人体内没有发现IN的同源类似物,因此,IN成为设计抗HIV-1药物的理想靶点。与逆转录酶和蛋白酶相比,对整合酶抑制剂的研究比较少,很大程度上是因为缺乏一个合适的、可以进行大规模初步筛选的模型。晶状体上皮细胞源性生长因子(LEDGF/p75)是第一个被发现的辅助IN完成整合作用的辅助因子。本研究就利用IN与LEDGF/p75相互作用为靶点,通过检测报告基因表达产生的酶活性以及氨基酸缺陷检测IN与LEDGF/p75相互作用程度,构建整合酶抑制剂筛选体系。用D77为正对照验证此模型,证实其特异性较强、结果稳定性好。据研究氧化应激与HIV-1存在着密不可分的关系,因此抗氧化剂很有可能存在着潜在的抗艾滋活性。相比合成类抗氧化剂,天然类抗氧化剂具有多效性、毒副作用低等特点,成为药物筛选的首选资源。本研究中利用构建的酵母双杂交筛选体系对14种天然产物进行了抗艾滋活性的探索,结果显示得出儿茶素、花青素、紫杉醇等小分子天然产物具有较好的抑制IN与LEDGF/p75相互作用活性。本研究选取了多种菇类子实体以抗氧化活性为指标进行初筛,最后确定以斑褐孔菌(Fomitiporiapunctata)子实体为研究对象。斑褐孔菌子实体粉末经一定浓度的乙醇高温浸提,大孔树脂、葡聚糖凝胶LH-20、HPLC分离纯化得到样品PD。对PD进行定性分析得出它是一种不含糖和蛋白等大分子物质的多酚混合物,其中多酚含量约为57.16%。在浓度为250μg/ml时,PD的抑制红细胞溶血活性约为65.1%,抑制脂质过氧化活性约为86.9%,超氧阴离子清除活性为93.7%,羟基自由基清除活性为84.8%。用所构建的酵母双杂交筛选体系检测PD对IN与LEDGF/p75相互作用的抑制活性,抑制率约为41%,并且还具有较好的抑制整合酶切割活性。该研究在一定程度上证明了天然产物的多效性以及抗氧化与抗艾滋之间有一定的关联,从抗氧化剂中寻找抗HIV-1活性的物质是可行的。本研究以IN与LEDGF/p75相互作用为靶点,构建了酵母双杂交筛选模型。为抗HIV-1以及其他以蛋白相互作用为基础疾病的药物筛选提供了有力借鉴,具有一定的理论价值和研究意义。关键词:整合酶;LEDGF/P75;酵母双杂交;抗氧化IAbstractHIV-1integrase(IN)isoneofthethreekeyenzymesinHIV-1.NofunctionalINanaloguehasbeenfoundinhumanbodies,therefore,INhasbecomeanidealtargetintheresearchofHIV-1.Comparedwithreversetranscriptaseandprotease,therearelessresearchofintegraseinhibitors.Thisislargelybecauseofthelackofaproperandcanbeusedforlarge-scalepreliminaryscreeningmodel.Lensepithelialcellsderivedgrowthfactor(LEDGF/p75)wasdiscoveredasthefirstcofactortohelpINtocompletetheintegration.Inthisstudy,webuildayeasttwohybridscreeningsystemontherelationshipbetweenINandLEDGF/p75.Wedefectthetwoproteininteractionthroughenzymeactivityandaminoacidsexpressedb
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