水稻组织mRNA分离-Bio-protocol.PDF

/e1010112 DOI:10.21769/BioProtoc.1010112 水稻组织mRNA 分离 方玉洁，沈建强，熊立仲* 作物遗传改良国家重点实验室，华中农业大学，武汉 *通讯作者邮箱：lizhongx@ 引用格式：方玉洁，沈建强，熊立仲. (2018). 水稻组织总 RNA 抽提. Bio-101 e1010112. Doi: 10.21769/BioProtoc.1010112. 实验原理：真核细胞mRNA 最显著特征是具有5’–端帽子结构和3–端的polyA 尾巴。 mRNA 的polyA 与oligo(dT)纤维素柱在高盐下亲和吸附。在低盐下吸附解除，因此可 利用该原理分离mRNA，再用有机溶剂沉淀可得纯化mRNA。 实验目的：从水稻组织中分离纯化mRNA，可以用于逆转录，RACE 和文库构建等后续 实验。 关键词：水稻，mRNA，分离 材料与试剂 1. 枪头及配套枪头盒：1 ml、200 μl、20 μl (AXYGEN) 2. 离心管和配套管架：1.5 ml (AXYGEN) 3. 50 ml 离心管：分装氯仿、异丙醇和酒精 4. 液氮 (湖北省畜牧局制氧厂) 5. 焦碳酸二乙酯 (DEPC, Sigma, catalog number: D5758) 6. 苯酚:氯仿:异戊醇 (体积比25:24:1) 或氯仿 (国药试剂，分析纯) 7. 异丙醇 (国药试剂，分析纯) 8. 无水乙醇或95% 乙醇 (国药试剂，分析纯) 9. 75%乙醇 (用95% 乙醇和0.1‰ DEPC 处理过的H O 配制) 2 10. TE 缓冲液 11. Tris-HCl 12. 糖原 (Glycogen) 13. NaAc Copyright © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 1 /e1010112 DOI:10.21769/BioProtoc.1010112 14. Micro-FastTrackTM 2.0 Kit (Invitrogen, catalog number: K1520-02) 15. 0.1‰ DEPC 处理水 (见溶液配方) 仪器设备 1. 研钵和研磨棒 2. 移液器：1 ml、200 μl、20 μl、10 μl、2.5 μl (Eppendorf) 3. 试剂瓶：250 ml 4. 4 °C 冷冻离心机 (Eppendorf, model: Centrifuge 5417R) 5. 紫外分光光度计：Nanodrop (Thermo Fisher) 6. -80 °C 冰箱 7. 灭菌锅 8. 计时器 9. 平板摇床或混悬仪 实验步骤 1. 液氮取样，按照 “水稻组织总RNA 抽提”抽提总RNA (25:24:1 或氯仿抽提2 次) (方玉洁等，2018)。 2. 从总RNA 中分离mRNA (每份总RNA 600 μg) 2.1 乙醇沉淀总RNA 并用80% 乙醇浸洗沉淀。 注：乙醇沉淀总RNA 时，-80 °C 冰箱过夜效果较好。 2.2 用10 μl Elution Buffer 重悬沉淀。 2.3 在灭菌离心管中将RNA 溶液加入到1 ml Micro-FastTrackTM 2.0 Binding Buffer 中。 2.4 65 °C 干浴5 min 后立即置于冰上1 min (精确计时)。 2.5 将总RNA 溶液加入到1 份oligo(dT)纤维素中，记录样品名。 2.6 oligo(dT)纤维素吸胀2 min。 2.7 室温轻柔摇晃离心管45 min (平板摇床，rotator 或手摇均可) 2.8 4,000 x g 离心5 min，弃上清，切忌扰动oligo(dT)纤维素沉淀。 3. 清洗oligo(dT)纤维素 Copyright © 2018 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC. 2