巴戟天对被微波损伤性腺轴雄鼠的治疗作用.doc

巴戟天对被微波损伤性腺轴雄鼠的修复作用 一、实验试剂： 放射免疫法试剂盒（测定FSH、PRL)，2%戊巴比妥钠，4%多聚甲醛，苏木精-伊红(HE)染料，10％中性福尔马林，3.5%重铬酸钾溶液，1.5%AgNO3双蒸水溶液，二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ，30％蔗糖蛋白甘油，0.1％焦油紫，SP染色法试剂盒，羊抗GnRH（一抗），兔抗羊（二抗），10%羊血清，10%正常兔血清，巴戟天(产地广东)购自广州中医药大学大药房，甲睾酮片(上海信谊药业有限公司，批号：020801)，规格5mg／片。 二、实验仪器： 微波发生仪及监测仪、眼科小剪子、Olympus2DP12摄像显微镜、精子分析系统、冷冻切片机、JA1203电子天平 三、实验步骤： （一）实验模型的建立：选取成熟雄性大鼠30只，随机平均分为3组，其中1组为空白组，1组为辐射组，1组为给药组。每组10只放入塑料盒中，动物自由体位，在相对湿度为45%，温度为18℃环境下进行饲养。 空白组：不采用辐射。 辐射组：采用900MHz辐照，平均功率密度为10mW/cm2，照射时间均为2h/d,持续一周。 给药组：采用900MHz辐照，平均功率密度为10mW/cm2，照射时间均为2h/d，持续一周。微波辐射完后,就开始在卯时（5：00~7：00）巴戟天灌胃给药，30g/kg，1次/d, 持续一周。 注：煎煮巴戟天：取900g巴戟天用7倍水浸泡1．5h，煎煮30min，药渣用4倍水煎煮20min，最后2者混合浓缩成300ml （二）性行为测定:1）实验前配备15只同种性成熟未交配雌鼠，雌鼠于实验前2d每天皮下注射2mg/kg复方苯甲酸雌二醇，促进其进入动情期。进行性行为实验时，挑取一只雄鼠放于观察笼中，适应环境3min，再放入一只处于动情期的雌鼠，测定雄鼠爬跨潜伏期、射精潜伏期、爬跨次数、射精次数、射精持续时间和射精间隔期等指标，每只雄鼠观察25min，观察时保持相对黑暗环境，于下午与晚上进行。观察时同时用摄像头记录。测试开始时，用以下标准和指标定量评价性行为: ①爬跨:雄鼠骑跨并用前爪抵住雌鼠双肋，其骨盆自发性迅速地猛烈撞击雌鼠; ②射精:随着性交过程中骨盆撞击速度增加，雄鼠出现剧烈的颤动及阴茎的深插，完成射精过程。在此过程中，雄鼠用四肢紧抱雌鼠，阴道涂片可找到精子; ③爬跨潜伏期:从合笼到第一次爬跨行为的时间; ④射精潜伏期:从合笼到射精开始之间的时间;⑤射精持续时间:在射精期间，雄鼠抱紧雌鼠的时间; ⑥射精间隔期:从有射精的爬跨结束到下一次具有射精的爬跨开始之间的时间； ⑦扑捉潜伏期:(captureincubationperiod，CIP)自雌鼠投入至雄鼠第一次扑捉雌鼠的时间。 2）统计学方法： SAS6112软件进行分析，结果以(x±s)表示，同时进行组间t检验比较，并进行回归分析。 （三）激素水平检测: 取大鼠外周血液，4000r/min，离心10min，放射免疫法测定血清样本中催乳素(PRL)、卵泡刺激素（FSH）水平，按试剂盒说明书操作。 （四）对大鼠睾丸、附睾的相关检测： 将大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(6ml/100g)麻醉后，取出睾丸和附睾组织。然后将睾丸逐一称重。 (1)标本制备：将其中一侧的睾丸组织灌流固定？（取出后用固定液固定），然后沿着与其长轴垂直的方向切为头段及尾段？（沿其长轴矢状切面切为头段和尾段）。睾丸组织在4%多聚甲醛中后固定过夜。常规脱水、透明、包埋，切片3～5μm，苏木精-伊红(HE)染色。(2)精子悬液制备:取另外一侧附睾，置于2ml生理盐水(37℃预温)的小平皿中，用眼科小剪子剪碎，吸管吹打，四层擦镜纸过滤。(3)组织形态学分析：从每个实验大鼠的头段及尾段睾丸组织切片中随机选取5张切片，每张切片中随机挑选10个视野，然后测量各视野中生精小管的管腔直径(tubulardiameter，TD)和上皮高度(seminiferousepitheliumheight，SEH)，并统计生精细胞的发育状况。组织切片的图像通过Olympus2DP12摄像显微镜(日本)拍摄获得，图像的具体测量及统计方法如下:TD及SEH的数值由沿着生精小管短轴的方向测量获得;生精小管中生精细胞发育状况由每个生精小管中处于最晚发育阶段的生精细胞类别决定，并统计处于不同发育阶段的生精小管所占的比率。生精细胞被分为以下几个发育阶段:精原细胞，细线前期至偶线期初级精母细胞，粗线期初级精母细胞至次级精母细胞，精子细胞(Ⅰ～Ⅷ期)，精子细胞(Ⅸ～ⅩⅣ期)，精子细胞(ⅩⅤ～ⅩⅨ期)。(4)精子参数测定:用计算机辅助精子分析系统？（精子悬液置于37 ℃孵育15 分钟, 用红细胞计数板, 在高倍镜下计数200 个精子中活动精子数。于60 ℃水浴中处死精子, 按红细胞计数法, 计数5 个中方格内精子数, 计为R