细胞培养技术实用篇王 云.pptVIP

将血球计数板及盖片用软纱布擦试干净，并将盖片盖在计数板上。 将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。 静置3分钟。 镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的 按下式计算： （细胞悬液的细胞数）/ml＝ （四个大格子细胞数/4)×稀释倍数×104 /ml 公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。 公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为： 1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3 。 要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中。 要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。 取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其是多次取样计数时更应该每次取样都要混匀，以求计数准确。 数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时只按照一个细胞计算。 如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计左线，不计右线。 操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。 在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，活细胞所占总细胞中的百分比叫做细胞活力。 由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。 复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。 细胞死亡后，细胞膜通透性改变，台盼蓝大量进入细胞内而不被排出呈蓝色。活细胞选择性强，不易着色 0.5ml台盼蓝＋0.3ml培养液＋0.2ml细胞悬液 染色5－15min 至少计数500个细胞中着色细胞数 细胞活力=（总细胞数－着色细胞)/总细胞数×100％ 原理：活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能将MTT黄色溶液还原成不溶于水的蓝紫色产物颗粒（formazan)，并沉积在细胞中。二甲基亚砜（DMSO）或酸性异丙醇能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅（以OD值表示）与所含的formazan量成正比。可反映活细胞的代谢水平。而死细胞没有这种功能 MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等 加入培养液量10％的MTT(5g/L)，继续3～4h培养 吸去培养液，加入等量异丙醇或DMSO，振荡10min 490/630nm 测定OD值 细胞存活率＝实验组OD值/对照组OD值×100％ 观察同一代细胞的增殖过程，根据细胞生长曲线分析细胞的增殖速度，确定具体实验、细胞传代、细胞冻存的最佳时间 计数细胞浓度，等量加入培养板各孔，培养7天 以接种时间始， 每隔24h计数3孔细胞数目，取均值 以横坐标为培养时间，纵坐标为细胞浓度（×104 /ml) 注：1、各孔消化时间应一致。 2、计数细胞前应混匀。 [3H]-TdR掺入法是将用[3H]标记的胸腺嘧啶脱氧核苷掺入到新合成的DNA中，通过测定[3H]放射性脉冲数比较不同细胞的增殖活性。 溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine ,BrdU）是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物,通过竞争掺入S期细胞单链 DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶。 BrdU被掺入到DNA复制位点，这些复制位点可用荧光剂或酶偶联的抗体检测。 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞 冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经 费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生 大的冰晶；相反，结晶很大，大结晶会造成细胞膜、细胞 器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形 成大冰晶，即冰晶的重结晶。 在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓 冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外 形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。 预先配制冻存液：含 10% DMSO、 20%血清培养基 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1×106 ～5 ×106细胞/ml)； 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。 冷冻过程要缓慢。4℃ 30－60 分钟→-20