《超分辨率显微技术》细胞成像技术小组展示.pptVIP

LOGO LOGO * 两道强干涉光照明，大部分荧光分子饱和，只有少数处在阴影下的未饱和，这些分子在增大光强度的同时，变得很小，小于PSF宽度。 * 如图1所示：具体是利用激发光使基态粒子跃迁到激发态，随后 STED光照射样品，引起受激辐射 ，消耗了发射荧光的能（荧光态）上的粒子数。 受激发射的作用是迫使粒子在它们被激发之后立刻回到基态 ，即焦斑那些受 STED 光损耗的荧光分子失去发射荧光光子的能力 ，而剩下的可发射荧光区被限制在小于衍射极限区域内，于是获得了一个小于衍射极限的发光点 。 * 由于在受激发射过程中所发出的荧光和自发荧光的波长及传播方向均不同，因此真正被探测器所接受到的光子均是由位于激发光斑中心部分的荧光样品通过自发荧光方式产生的。 * /tutorials/flash/superresolution/storm/index.html * J. Cell Biol. Vol. 190 No. 2 165–175 * J. Cell Biol. Vol. 190 No. 2 165–175 * 超分辨率显微技术Super-resolution Microscopy 超分辨率显微技术 SSIM 2 STED 3 GSD 4 STORM 5 总结 6 NSOM 1 近场扫描光学显微镜 Near-field Scanning Optical Microscope (NSOM) 远场：从近场区域起至无穷远处 近场：距离物理表面仅几个波长的区域 辐射场：可向外传输的场成分 非辐射场：被限制在样品表面并且随离开表面的距离增加而迅速衰减，不能在自由空间存在 探测束缚在物体表面的非辐射场 丰富的亚微米光学信息 利用孔径小于50 nm的光纤探针，并且精确地在样品表面几十纳米以内稳定、可靠地进行光学信息的扫描成像，即扫描近场光学显微镜，其光学分辨率达到波长的几十分之一。 物镜：孔径小于波长的小孔装置，如光纤探针 探针与样品间距的测控 光源和照明光路、收集光路和光探测器 关键组件 成像原理 优点 超越光学衍射极限的分辨率，甚至可达到亚纳米量级； 光学显微技术，无侵入性，可在生物的自然状态环境下进行观测研究； 能够观测吸收、反射、荧光、偏振对比度，透视生物样品内部光学性质； 光谱学分析，对化学状态具有高分辨率； 局域(纳米级)光与样品的相互作用； 单分子水平观测灵敏度，1 photon/ sec ； 纳米空间分辨率，高时间分辨率(飞秒) ； 能在室温条件下工作 缺点 贵 NSOM优缺点 应用 生物学：有静态的形貌像的观察研究，如细胞的有丝分裂，染色体的分辨与局域荧光，原位DNA，RNA的测序，基因识别等，还有利用观察形貌像随时间变化的动力学过程的研究。 微电子：信息的高密度存储 工作原理：非线性结构性光学照明部件引入到传统的显微镜，多重相互衍射的光束照射到样本上，然后从收集到的发射光模式中提取高分辨率的信息。 饱和结构光照明显微技术 Saturated structure illumination microscopy, (SSIM) 优点：1、光源只需使用一个廉价的激光。 2、可以突破分辨率的界限，很大程度上提高分辨率，理论上可以实现无穷大的分辨率。 二位点分辨率实现50nm。 缺点：1、跟通常的光照强度相比，饱和状态会使得荧光分子的漂白率加快，同传统的单一图像相比，饱和结构光显微镜所观察到的光子数需要很高的信噪比。 2、饱和结构光显微镜实现高分辨率是在样品静止不动的假设上进行的，对于有着高速度的胞内生命活动，成像会被限制成滞缓的结构。 3、对于活标本的观察，饱和结构光显微技术会大大增加光毒性。 SSIM优缺点 受激发射损耗显微术 Stimulated emission depletion microscopy (STED) 在STED中，有效荧光发光面积的减小是通过受激发射效应来实现的。一个典型的STED显微系统中需要两束照明光，其中一束为激发光，另外一束为损耗光。 装置图 优点： 1. STED远场显微术，不仅具有共聚焦非接触三维成像的功能，而且成功突破了衍射极限的限制 ，使分辨率提高到了几十纳米。 2.与近场扫描光学显微镜相比，不仅突破了衍射极限，而且使观察不仅局限在样品表面，而可以看到样品内部。 缺点： 1.需要强光，能量利用率低； 2.过强光会引起光致漂白； 3.应用范围略窄； 4.与其他的超分辨显微镜相比，成本较高，操作 PLAM/STORM复杂。 STED优缺点 基态损耗超高分辨率显