《超分辨率荧光显微成像技术》细胞成像技术小组展示.pptVIP

物体亚波长结构的信息隐藏在隐失场中。隐失场的强度随着离物体距离的增大而迅速衰减，衰减的速度 与空间频率成正比，所以结构越是精细，场就越被强烈地束缚在物体表面。而远场只有传播波，仅包含电磁 场的低空间频率部分，不包含样品的亚波长结构信息。瑞利判剧建立在远场探测传播场的基础之上，仅在远 场成立，而近场的隐失场并不受它的约束。因而，若想获得超衍射极限的分辨率，必须利用近场隐失场。 * 点扩散函数工程超分辨率显微成像技术(STED/RESOLFT) 光激活定位显微技术(PLMA) 近场光学成像技术(NSOM) 超分辨率荧光显微成像技术 点扩散函数工程超分辨率显微成像技术 一个典型的STED 显微系统中有两束照明光，其中一束为激发光，另外一束为损耗光。当激发光的照射使得其衍射斑范围内的荧光分子被激发，其中的电子跃迁到激发态后，损耗光使得部分处于激发光斑外围的电子以受激发射的方式回到基态，其余位于激发光斑中心的被激发电子则不受损耗光的影响，继续以自发荧光的方式回到基态。由于在受激发射过程中所发出的荧光和自发荧光的波长及传播方向均不同，因此真正被探测器所接受到的光子均是由位于激发光斑中心部分的荧光样品通过自发荧光方式产生的。由此，有效荧光的发光面积得以减小，从而提高了系统的分辨率。 ( a) STED 显微术的基本超分辨原理; ( b) 受激发射过程中的非线性效应 10． 3969 /j． issn． 1007-7146． 2013． 02． 002 紫色代表的是激发激光，黄色代表的是用来受激发射损耗的激光，两束激光经过时间空间调制后同时照射在样本上 由右图可以看出激发光光斑（紫色）经STED激光（黄色）的调制后极大的减少了激发的荧光分子的光斑大小(绿色），其半高宽可以达到66nm. Nature, 2006, 440(7086): 935～939 点光源光斑的半高宽 其中I是STED 激光器的最大聚焦强度，而I sat则是当受激荧光强度被减少到1/e时的STED 激光的强度特征值。由此公式可看出，当I/Isat的值趋近无穷大时，STED 成像的点光源的半高宽趋近于0，即分辨率不再受光的衍射过程所限制。 Nature, 2006, 440(7086): 935～939 ( a) Confocal image of fluorescent nanoparticles; ( b )STED image of fluorescent nanoparticles; ( c) Confocal image of human neurofilament; ( d) STED image of human neurofilament STED的缺点：STED 成像的主要缺陷在于光路复杂，设备昂贵，对系统的稳定性要求很高。 STED的优点：成像速度快，可以快速地观察活细胞内实时变化的过程。 光激活定位显微技术的基本原理PALM 光激活定位显微技术的基本原理是用PA-GFP 来标记蛋白质，通过调节 405 nm 激光器的能量，低能量照射细胞表面，一次仅激活出视野下稀疏分布的几个荧光分子，然后用 488 nm 激光照射，通过高斯拟合来精确定位这些荧光单分子。在确定这些分子的位置后，再长时间使用 488 nm激光照射来漂白这些已经定位正确的荧光分子，使它们不能够被下一轮的激光再激活出来。之后，分别用 405 nm 和 488 nm 激光来激活和漂白其他的荧光分子，进入下一次循环。这个循环持续上百次后，我们将得到细胞内所有荧光分子的精确定位。将这些分子的图像合成到一张图上，最后得到了一种比传统光学显微镜至少高 10 倍以上分辨率的显微技术。 Science, 2002, 297(5588): 1873～1877 原理 Science, 2006,313(5793): 1642～1645 PALM技术局限性 PALM 的成像方法只能用来观察外源表达的蛋白质，而对于分辨细胞内源蛋白质的定位无能为力． PALM技术的改进三维PALM成像技术 散光原理成像 基于单荧光分子显微成像的 PALM 和 STORM技术可以通过多种方法来改进其在 z 轴上的分辨率。一种方法是利用散光的原理来提取 z 轴方向上的精细信息．具体的方法是在成像物镜和图像透镜之间加上一个散光的柱面镜，从而产生 xy 轴向上的光程差。当点光源位置正在聚焦平面时，其投射到 CCD 上的光斑与正常的显微镜一样，都是一个四面对称的圆形。而当点光源位置不在聚焦平面时，其投射到 CCD 上的点扩散光斑会呈现椭圆形状，其椭圆长轴的指向和长度分别决定了点光源位置在聚焦平面的上下以及离聚焦平面的距离。 Science, 2008, 319(586