12-病毒感染的实验室诊断.ppt

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12-病毒感染的实验室诊断

病毒感染的实验室诊断 病毒感染的实验室诊断: 指从病人、带毒者、外环境中采集标本经过适当的处理,采用一系列物理、化学、生物学等手段,将病毒从标本中分离出来,并通过有关特异性方法鉴定病毒的全过程。 第一节 标本的采集和处理 一、标本的采集 根据发病规律和病程取相应的标本。 采集部位: 从病原体入侵部位取材:流感病毒取咽喉拭子 从病原体感染的靶器官取材:HIV患者取血 从病原体排泄途径采集;HAV、HEV及轮状病毒 从环境取材:空气、水、土壤、生物材料等 采集时间: 早期采集/早期-晚期采集。 二、标本的运送与储存 标本采集后尽快送检 不能及时检验,应注意保存 耐低温的病毒标本温度越低越好 血液标本等4℃保存 采集标本时注意防护,避免被感染 做好标记 组织块:置50%中性甘油盐水中送检。 三、标本的处理 目的:提高病毒分离率,防止标本污染。 鼻咽等拭子标本的处理 加1000U/ml的青霉素和链霉素处理后再离心 血液标本的处理 需抗凝血,离心后取血浆 粪便标本 加10000U/ml的青霉素和链霉素处理,过夜后加适量Hanks液和少量石英沙,使病毒充分释放,离心后取上清 尿液标本的处理 加1000U/ml的青霉素和链霉素处理, 4℃作用4h 脑脊液标本的处理 组织标本的处理 先剪成碎块后再匀浆,再按粪便标本方法处理 生物标本的处理 类似组织标本 水体标本 病毒为严格活细胞内寄生物,在无生命环境中不能生长,常用于病毒分离培养的方法包括:细胞培养、鸡胚接种、动物培养。 一、细胞培养技术 细胞培养技术 定义 对组织分散的单个细胞或某型细胞群进行的体外培养方法 即模拟体内的生理条件,提供细胞适宜的营养条件和温度在无菌操作的基础上,使离体组织细胞生长繁殖并进行传代的技术 组织培养 器官培养 组织培养 细胞培养 细胞培养的优点 为病毒提供了生理特性基本一致的环境 可消除动物试验中特异性抗体或非特异性抑制因子的影响 易进行无菌操作 易显示病毒增殖的特征如CPE 可通过多种方法判断病毒类型:病毒核酸类型,血凝试验、免疫荧光和酶 可定性和定量监测病毒量;空斑试验和50%组织培养感染剂量(TCID50) 结合分子生物学技术可进行病毒快速检测 1、原代细胞培养(primary cell culture) 来源人或动物的胚胎组织或正常组织 常用的原代细胞主要有:人胚肺、人胚肾、人胚肝、鸡胚、地鼠肾、地鼠肝、猴肾等 特点:对病毒敏感性最高,但制备烦琐,保存不易,一般只能传几代 2、二倍体细胞培养(diploid cell culture) 染色体仍保持二倍体特性,染色体总数为46条,属于正常细胞 缺点:一般只传50代,随着代数的增加,敏感性降低 非常安全,常用于分离鉴定病毒和疫苗生产 常见的有:WI-38、WI-26 3、传代细胞培养(continuous cell) 由原代细胞连续传代或由肿瘤细胞培养而来 常见的有:BHK21(传代地鼠肾)、HeLa(宫颈癌)、Vero(传代非洲绿猴肾)、A549(人肺癌) 易于保存、使用方便 细胞培养技术 (一)细胞培养的设施和条件 常用设备与器材 实验设施与设备:万级无菌室,超级工作台、倒置显微镜、CO2孵箱、离心机、低温冰箱、液氮罐及高压蒸汽灭菌器、干烤箱、滤菌器 实验器材:培养瓶、培养板 实验器材的处理 玻璃器皿:浸泡 包扎与灭菌:处理完后再烘干 滤过除菌:细胞培养液、血清等,常用滤膜孔径0.45μm 常用试剂和培养液 (二)无菌操作技术和细胞检查技术 无菌操作技术 紫外灯照射,注意75%酒精消毒台面 所有过程均要无菌操作 细胞检查技术 活细胞形态观察:倒置显微镜 细胞计数:血球计数板 细胞常用台盼兰染色:活细胞拒染,死细胞为蓝色,活细胞比例超过95% (三)细胞冻存、复苏及运输 细胞的冻存 加冻存液甘油和二甲基亚砜(DMSO),防止冰晶形成 在-20℃~0 ℃缓慢冰冻,最后-70 ℃保存 细胞的复苏 在室温下快速融化 细胞运输 优点: 为一活的机体,有神经血管的分布及脏器的构造 组织分化程度较低,可多种途径接种,病毒易繁殖,在病毒感染的膜和液体中含有大量的病毒 鸡胚来源充足,很少携带病毒和细菌,对多种病毒敏感,不产生抗体 缺点: 不产生特异性指征 可被食入的抗生素抑制感染物 可携带细菌(沙门氏菌)和病毒(Rous肉瘤病毒) 尿囊腔接种 流感病毒、流行性腮腺炎病毒、新城鸡瘟病毒的传代 取9-11日龄的鸡胚 检卵灯下划出气室和胚胎位置 收集尿囊液前4 ℃冰箱过夜 羊膜腔接种 分离流感病毒;收集羊水和尿囊液 收集前4 ℃冰箱过夜,目的是冻死鸡胚,使血液凝固,避免病毒凝集红细胞造成滴度的下降 绒毛尿囊腔接种 牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒的分离,可在膜上出现斑点状或痘疱状

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