沼水蛙抗菌多肽brevinin-GHa的分离提纯及其结构研究.docVIP

沼水蛙抗菌多肽brevinin-2GHa1的分离提纯及其结构研究 　　在自然环境下，两栖动物受到紫外线、病原微生物的伤害及捕食者的威胁． 面对恶劣的自然环境，两栖动物体表进化出许多特殊的腺体，这些腺体能够分泌丰富多样的生物活性肽，如抗氧化肽、抗菌肽、抗病毒多肽等，其中的抗菌肽研究已取得诸多进展． 有研究者仅从 Odorrana grahami 中就发现了107 种新型的抗菌肽． 目前已经发现的两栖动物抗菌肽已有上千种，研究者根据沼水蛙抗菌肽的氨基酸序列，将其分成 brevinin、esculentin、nigrocin 和odorranain 等不同家族． 多种抗菌肽相互配合，快速有效地消灭病原微生物，成为两栖动物生存繁衍的有效保障之一．沼水蛙学名 Hylarana guentheri，广泛分布于中国南部和一些东南亚国家． 沼水蛙皮肤能够分泌多种抗菌肽． 目前，已从沼水蛙皮肤分泌物中获得分别属于 brevinin、temporin 和 guentherin 家族的 9 种抗菌肽． 在不同的生活环境下，两栖动物会分泌不同的抗菌肽来适应新的环境，沼水蛙抗菌肽的开发利用需要更多研究． 本文通过电刺激法获取沼水蛙皮肤分泌物，利用凝胶过滤色谱和高效液相色谱进行分离纯化，获得了 1 种新的抗菌多肽 brevinin-2GHa1，并对其抗菌活性和溶液结构进行了研究． 　　 　　1 材料与方法 　　1. 1 材料 　　野生成年沼水蛙捕捉于福建省福清，数量 n =18，体长 80 ～ 90 mm; 三氟乙酸( trifluoroacetic acid，TFA) 、三氟乙醇 ( trifluoroethanol，TFE) ，购于德国CNW Technologies GmbH 公司; Sephadex G-50 凝胶过滤色谱填料购于美国 GE 公司; 甲醇和乙腈( 高效液相色谱纯) 购于德国默克公司; 其它试剂均为国产分析纯．LC-20A 岛津高效液相色谱，Gemini 5 μ C18 反相高效液相色谱柱( 250 mm ×4. 6 mm) ，J-810 圆二色谱仪，XZ-21K 型高速冷冻离心机，FD-1C-50 冷冻干燥机，752 型紫外可见分光光度计，TSQ-280 培养箱，BS-160A 自动部分收集器，BT01-100 蠕动泵驱动器，MILLI-Q 型超纯水机． 　　 　　1. 2 沼水蛙皮肤分泌物抗菌肽的分离纯化 　　提取沼水蛙皮肤分泌物: 电刺激法稍作修改． 市售 10 V 直流电池适度刺激沼水蛙耳后及背部腺体发达的部分皮肤，间隔 5 s 刺激 1 次，每次持续 1 s． 待实验个体皮肤表面产生大量分泌物，采用 0. 05% ( V/V) 三氟乙酸酸化，去离子水冲洗，收集冲洗液，离心 12 000 r/min，10 min，取上清液，置于-80冰箱迅速冷冻后做冷冻干燥处理，保存于-20备用．Sephadex G-50 凝胶过滤色谱: 去离子水溶解沼水蛙皮肤分泌物冻干粉，12 000 r/min 离心10 min．取上清液用 0. 22 μm 孔径的微滤膜过滤． 滤液上样用0. 5% ( V/V) 的三氟乙酸水溶液平衡的 SephadexG-50 凝胶柱( 1. 6 cm × 100 cm) 分离． 洗脱液为 0. 5%( V/V) 的三氟乙酸水溶液，流速0. 3 mL/min，每10 min收集1 管洗脱液，于214 nm 波长检测吸光值． 收集洗脱峰，冷冻干燥． 滤纸片法测定其抗菌活性，对有活性的组分进一步分离纯化．反相高效液相色谱: 去离子水重新溶解具有抗菌活力冻干组分，离心 12 000 r/min，10 min，收集上清液，经 0. 22 μm 滤膜过滤并上样至反相高效液相色谱． 液相色谱系统为 LC-20A，装配 Gemini 5 μC18( 250 mm × 10 mm) 反相柱 ( Phenomenex，UK) ．以含 0. 05% ( V/V) 三氟乙酸的乙腈水溶液为流动相，进 行 梯 度 洗 脱，检 测 波 长 214 nm，流 速 为1. 0 mL / min，洗脱时间 40 min． 洗脱梯度为: 0 ～5 min，20% 乙腈水溶液; 5 ～ 40 min，20%→70% 乙腈水溶液． 收集具有抗菌活性的峰，冷冻干燥后于-20 保存备用． 　　 　　1. 3 抗菌活性的测定 　　纸片法测定跟踪样品的抑菌活力: 所用菌种为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌． 具体操作如下: 挑取单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，过夜振摇培养( 37，130 r/min) ． 取 200 μL 过夜培养物接种于 20 mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基中，振摇培养4 h ( 37，130 r/min) 获得菌悬液． 将菌悬 液 稀 释 1 0