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滇藁本中黄酮类化合物提取工艺 　　摘 要：目的：研究彝药滇藁本总黄酮的最佳提取工艺。方法：以槲皮素为对照品，HPLC测定的槲皮素含量和总固体物收率为指标，考察提取方法加醇量、提取时间、乙醇浓度对滇藁本总黄酮提取率的影响。结果：加醇量、提取时间、乙醇浓度对滇藁本药材粗粉的槲皮素含量和总固体物收率都有显著的影响，而提取时间影响最显著。最佳提取工艺为药材与70％乙醇按照1：8（g/mL）的比例，75 ℃回流提取3 h。结论：本实验优选出了滇藁本中黄酮的最佳提取工艺，为滇藁本中黄酮类化合物的进一步研究提供依据。? 　　关键词：滇藁本；黄酮类；正交实验；高效液相法? 　　中图分类号：R284.2文献标识码：A? 　　文章编号：1007-2349（2012）01-0053-03?? 　　彝药滇藁本为伞形科滇芹属（Sinodielsiayunnanensis Wolff），别名岩林、岩前胡，产自云南中部和西部，始载于《滇南本草》，治头风疼痛，止诸头疼，明目[1]。彝族主要用于偏头痛，肾盂肾炎，呼吸道感染等症[2]。初步研究表明，滇藁本能减缓血细胞凝聚。为了更好的挖掘利用民族药资源，最大限度的提取其中的有效成分，笔者对滇藁本进行了醇提工艺的研究，建立了滇藁本中总黄酮类化合物的高效液相色谱测定方法。? 　　1 材料与方法? 　　1.1 药 材、仪器及试剂 药材：滇藁本采自红河哈尼族彝族自治州泸西县，经鉴定为伞形科滇芹属（Sinodielsiayunnanensis Wolff）的根部，粉碎过40目筛，干燥保存。试剂：盐甲醇（色谱纯）；槲皮素（对照品，中国药品生物制品检定所）；去离子水。仪器：Agilent1100型高效液相色谱仪、Zorba/sb-C18?色谱柱（150.0 mm ×4.6 mm，5 μm）、紫外检测器、自动进样器、在线真空脱气机、智能化柱温箱及Agilent化学工作站、R-?114型旋转蒸发仪（BüchI）、电热恒温水浴锅、CQX25-06超声波清洗器、AE100型电子天平。? 　　1.2 方法和结果? 　　1.2.1 黄酮类检测 取滇藁本药材粗粉10 g，加甲醇70 mL，?置水浴中回流10 min，趁热过滤。取滤液2滴于滤纸上，加10%三氯化铝乙醇溶液2滴，挥干，置荧光灯下观察，有荧光产生。? 　　1.2.2 提取工艺条件的确定 采用正交试验来确定滇藁本中黄酮类化合物最佳提取工艺条件。以总黄酮的提取率为评价指标，乙醇浓度（A）、乙醇用量（B）、提取方法（C）、提取时间（D）为考察的4个因素，每个因素各取3个水平（表1），选用L?9（3?4）正交表进行试验（表2）。取药材每份50 g，提取液过滤、减压蒸馏浓缩浸膏，再定容至50mL容量瓶中，作为供试液备用。测定前充分摇匀。按正交试验设计要求试验。? 　　 　　 　　1.2.3 结果方差分析 对正交试验结果进行方差分析，由滇藁本药材粗粉中槲皮素含量的直观分析结果可知，各因素对实验结果的影响程度为ADBC，所得最佳提取工艺为A?3B?1C?1D?3。由方差分析可知，提取方法、加醇量、提取时间、乙醇浓度对滇藁本药材粗粉的槲皮素含量和总固体物收率都有显著的影响，但提取时间影响最显著，确定最佳提取工艺为A?3B?1C?1D?3。即加8倍量的70%乙醇，热回流提取3 h。F?1-0.05（2，2）?=19.0,F?1-0.01（2，2）?=99.0,F?1-0.10（2，2）?=9.00。? 　　2 实验内容? 　　2.1 对照品贮备液的制备 取干燥至恒重的对照品，精密称定，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。? 　　2.2 供试品溶液的制备 取样品约5 mL，用20 mL甲醇于超声波浴中提取30 min，过滤后滤液加入20 mL 1.5 mol/L盐酸于水浴上回流水解3 h，冷却后用甲醇定容至50 mL量瓶中，该样液过0.5 μm膜，滤液进HPLC分析。? 　　2.3 测定波长的选择与色谱条件 色谱条件 固定相：Zorba/sb-C?18?色谱柱（150.0 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1 %磷酸（50∶50）；流速：1 0 μL /min；检测波长：371 nm；柱温：20 ℃。分离度符合要求。测定波长的选择 使用HPLC在线扫描槲皮素的对照品紫外光谱图中（以流动相为溶剂），最大吸收波长为371 nm（见图1）。根据实验结果，为使成分的色谱峰相匹配，本实验中选择371 nm为测定波长。? 　　? 　　图1 HPLC在线扫描槲皮素对照品紫外光谱图? 　　2.4 系统适用性试验 分别吸取供试品及对照品溶液，注入色谱仪，在上述色谱条件下进样，得HPLC图谱（见图2（A、B），分析得系统适用性实