小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验.ppt

小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 目的：了解小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验原理，练习实验方法。 实验原理 微核试验（micronucleus test)是检测环境致癌物的方法。微核实质上是·孤立畸变染色体在间期的存在形式。在癌症患者末梢血淋巴细胞浆中，表现有一定的规律性。也存在于受环境污染的鱼类、两栖类和鸟类末梢血有核红细胞胞浆内，并能用药物诱发，使实验动物或胚胎在出现恶性体征之前，在血细胞或其他细胞中出现微核。因此微核试验是筛选致癌物、致突变物的重要手段之一，也是预报致癌危险及其他遗传危害的短期测试方法。 实验原理 微核检测既可直接检测体内细胞，亦可利用培养细胞进行检测。凡具分裂能力易于获得的培养细胞以及很多其他细胞，都可用于显示微核。在骨髓和外周血液的有核细胞中均可见到。但是，在这类只有少量胞浆的有核细胞中，微核常难以与正常核叶及核的突出物相鉴别，而在无核的嗜多染红细胞(PCE)的胞浆中，微核却十分易于辨认，PCE是分裂后期的红细胞由幼年发展为成熟红细胞过程中的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，因胞质内含有核糖体，染色后易与成熟红细胞鉴别。 实验原理 骨髓中PCE数量充足，微核容易辨认，而且微核自发率低。由于这些优点，骨髓的PCE细胞成为骨髓微核试验的首选细胞群。故一般检查嗜多染红细胞中微核的多少来鉴别是否异常; 试剂和材料 主要试剂 胎牛血清 材料： 小平皿、滤纸、载玻片、离心机、显微镜 成年小鼠，体重18-22克。 实验步骤 灌药 制片 实验步骤（灌药） 骨髓嗜多染红细胞微核试验要求给药后短期内，能在骨髓内达到有效药物浓度，常由腹腔和经口给药，给药次数可有三种方式:一次给药、两次给药(间隔24h)以及每日一次，连续五次给药。 实验步骤（制片） (1)骨髓液的制备 将小鼠颈椎脱白处死，剪取双侧股骨，剔净肌肉，用滤纸擦掉附在股骨上的血污和肌肉，剪掉股骨头，露出骨髓腔。用注射器(6号针头)吸取胎牛血清lmL，将针头插入骨髓腔内少许，将骨髓腔内骨髓冲入离心管中，然后，用毛细吸管轻轻地吸打骨髓，使成均匀的混悬液。 实验步骤（制片） (2)离心 以10OOrpm离心5min，用毛细吸管吸去上清液。如沉淀物较多，可留下少许血清，否则应吸去全部上清液。最后，用毛细吸管尖端把沉淀物混匀。 (3)涂片 吸取一小滴混悬液滴于玻片的一端，按常规血涂片法涂片，约2·3cm长度，在空气中晾干(若立即染色，可在酒精灯上稍加烘烤)。 实验步骤（制片） (4)固定 放在甲醇液中固定5~1Omin，如当日不染色，也需固定后保存。 (5)染色 在Giema应用液中染色10~l5min，最后用蒸馏水冲洗。 观察计数 选择细胞分散均匀、形态完整、染色良好的区域，在油镜下按一定顺序进行嗜多染红细胞(PCE)及微核计数。嗜多染红细胞呈灰蓝色，而成熟红细胞呈桔红色。PCE中微核的嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。典型的微核呈圆形，边缘光滑、整齐，其直径通常为红细胞的1/20~1/5。偶尔也可呈椭圆形、肾形、马蹄形及环形。PCE中微核多数为一个，也可能有两个或两个以上的微核，此时仍按一个有微核的PCE计算。每只动物计数200O个PCE，观察含有微核的PCE数，微核率以千分率表示。 结果评价 正常小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率为千分之五以下，超过千分之五为异常 。 * *