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聚焦生物工程中“筛选”问题 　　近年来，关于生物工程中的“筛选”问题在各地的高考试题和模拟试题中多次涉及，它不仅考查了学生的分析推理能力、实验设计能力，还能考查学生获取信息应用知识的能力。下面，笔者就生物工程中的“筛选”问题作一具体分析。 　　 　　1、基因工程中重组DNA分子的筛选 　　基因工程的第一步是提取目的基因，第二步是将目的基因与运载体结合，即把用同一种限制性核酸内切酶处理的目的基因与运载体混合，再加入DNA连接酶，使DNA片段相同的黏性末端能够连接起来，因为这些DNA有相同的黏性末端，所以在DNA连接酶的作用下，必然形成一个封闭式的环状的DNA。这些环状的DNA有的是由一个DNA片段形成的，共有两种，即目的基因环状物和运载体环状物；有的是由两个DNA片段形成的，共有三种，即目的基因―载体连接物、载体―载体连接物 、目的基因―目的基因连接物。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行分离纯化。常用的方法有抗药性标记选择法（插入失活法），即将目的基因插入带ampR和tctR基因载体的tctR基因（或ampR基因）中，则tctR基因（或ampR基因）失活，再在分别含有氨苄青霉素和含四环素的两个培养基中培养，进行筛选。 　　[例1]：(2008海南高考题) 右图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，P为启动因子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。 　　 　　（1）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有__________、__________、__________三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行__________。 　　（2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞接种到含四环的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是____________________。 　　（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是 ，其合成的产物是______________________________。 　　（4）在上述实验中，为???防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶时 。 　　[解析]：考查基因工程重组DNA的构建与筛选，以及基因结构与表达调控。 　　(1)考虑载体的自连接、目的基因的自连接及载体和目的基因的相互连接。 　　(2)载体―载体连接物含有ampR(青霉素抗性基因)和tctR(四环素抗性基因)，其宿主细胞接种到含四环素、青霉素的培养基中均能生长。由于目的基因插入tctR四环素抗性基因位置，使得该四环素抗性基因完整性破坏而不能表达，但因含有tctR(四环素抗性基因)，所以将相应宿主细胞接种到含四环素的培养基中不能生长，接种到含青霉素的培养基中能生长。 　　(3)目的基因表达时,RNA聚合酶识别和结合位点是启动子，作为转录起始信号，其合成产物是mRNA。 　　(4)质粒包括EcoRI、BamHI酶切位点，目的基因的两端分别有EcoRI、BamHI酶切位点,若用该两种酶同时处理质粒、目的基因会得到相同黏性末端，其目的基因――载体连接物就只能有一种。当然还有若干载体――载体连接物、目的基因-目的基因连接物。 　　[答案]： 　　（1）目的基因―载体连接物 载体―载体连接物 目的基因―目的基因连接物 分离纯化 （2）载体-―载体连接物；目的基因-―载体连接物、载体―载体连接物 （3）启动子 mRNA （4）EcoRI和BamHI 　　[例2]：科学家利用基因工程成功地将人的胰岛素基因导入大肠杆菌体内生产出人的胰岛素。在该过程中采用质粒作为运载体，已知质粒上含有抗氨苄青霉素（简称氨苄）和抗四环素的基因（位于不同区段），目的基因与质粒的结合位点刚好位于抗氨苄青霉素基因结构内，且受体大肠杆菌体内不含质粒，也不含质粒上的抗药基因。导入完成后，在得到的大肠杆菌中，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是普通质粒，只有少数导入的是重组质粒。某科研机构想从培养基上筛选出含重组质粒的大肠杆菌（即“目的菌种”），他们设计了如下实验方案： 　　第一步：将得到的大肠杆菌接种在含的培养基上，筛选出含有质粒的大肠杆菌。 　　第二步：为选出“目的菌种”，将第一步筛选出的大肠杆菌中选用“印影法”分离。 　　①采用涂布平板法，将第一步筛选的大肠杆菌以合适的稀释度涂布_______________________上，经培养后形成单菌落，如图1B所示。