定点突变技术研究苏云金杆菌CrY1类晶体蛋白结构与功能进展.docVIP

定点突变技术研究苏云金杆菌CrY1类晶体蛋白结构与功能进展 　　张春艳　胡胜标　单世平　夏立秋 　　摘要：近年来利用定点突变技术研究苏云金杆菌(Bacillus thuringiesis Bt)杀虫晶体蛋白(Insecticidal crvstalproteins，ICP)作用机制已取得良好进展，杀虫晶体蛋白不同结构域上氨基酸残基的突变将影响其稳定性，与受体的结合，不可逆的昆虫中肠膜插入及离子通道活性的强弱等，突变研究表明，结构域Ⅰ参与不可逆结合及插入昆虫中肠膜过程；结构域Ⅱ参与受体结合，包括初始结合与不可逆结合；结构域Ⅲ在杀虫特异性和维持三维结构的稳定性方面起重要作用，同时。可能参与离子通道的形成，受体结合和插入昆虫中肠膜过程，利用各种定点突变技术对各位点进行突变可以研究单一位点的功能，到目前为止，已有很多关于这方面的研究，并且筛选到了毒力提高的工程菌株。 　　关键词：苏云金杆菌：杀虫晶体蛋白：定点突变 　　中图分类号：Q933 　　文献标识码：A 　　文章编号：1007―7847(2007)02.0095―05 　　苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis.Bt)是一种革兰氏阳性菌，Bt制剂被广泛应用于害虫防治，Bt在形成芽孢期间，能形成伴孢晶体，伴孢晶体在杀虫过程中起主要作用，它被昆虫吞食后，在中肠液碱性环境下被溶解，原毒素被肠液中蛋白酶降解成活性肽段，然后与中肠上皮细胞刷状缘膜(brush border membrane vesicles.BB-MV)受体结合，再插入中肠上皮细胞，形成离子通道，使渗透压失衡，导致昆虫死亡，在杀虫过程中，原毒素分子各结构域所起作用不同，为了探讨其作用机理，人们尝试利用各种技术如二步PCR法、寡核苷酸引物法及结构域的杂交等方法突变预期位点以研究其功能，目前应用最广泛的是定点突变法，定点突变(site-directed mutagen-esis)技术可以在已知DNA序列中任意取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段，该方法比使用化学因素、自然因素导致突变的方法具有突变率高、简单易行、重复性好的特点；除用于改变核苷酸序列获得突变基因、研究基因的结构与功能的关系之外，还能够通过改变特定的氨基酸获得突变蛋白质，研究蛋白质的结构与功能，从微观水平上阐明正常状态下基因的调控机理、疾病的病???和机理。 　　 　　1突变对Cryl类毒素的结构和功能的确定 　　 　　1.1结构域Ⅰ的突变 　　结构域Ⅰ包括N端200多个氨基酸，大多具疏水特性，由8个反平行的螺旋扭成一束，a5位于中央，被其它螺旋所包围，结构域Ⅰ在中肠膜插入和孔道形成中发挥作用，毒素在细胞膜上形成孔道是先插入由疏水性的а5和两亲性的а4螺旋组成的发夹，Vincent Vachon等人曾报道CrylAa а3上突变E101C、E101Q、E101K、E116K、E116Q、E118C离子通道形成能力都大大降低，说明结构域Ⅰ上突变明显影响了离子通道的形成，在结构域Ⅰ上Cry1Aa R28V、R87A，Crv1Ac R93和Cry1Aa R99对毒力影响较大，且R99突变为其他氨基酸后失去了离子通道形成能力，CrylAaα4上带电氨基酸残基突变后，pH 7.5时，离子通道形成能力大大降低，T142D和T143D活性几乎完全丧失，R127E、R127N、R131H对蔗糖、棉子糖通透性大，而R131D和R13lH形成的孔道直径比野生型CrylAa要小，Nunez Valdez等人电压钳实验表明：A(不带电荷)92E(带负电荷)和Y(不带电荷)153D(带负电荷)离子通道形成能力降低，解离结合实验中这两个突变子与BBMV的不可逆结合明显降低，毒力也明显降低，而Y(、不带电荷)153A(不带电荷)和Y(不带电荷)153R(带正电荷)没有影响可逆结合和毒力，A(不带电荷)92D(带负电荷)对烟草天蛾(Manduca sexta)毒力大大降低，可能这个位点的突变能影响毒素从毒素受体复合物中解离的能力，92、153位只有引入带负电荷的氨基酸才会导致毒力的降低，所以带正电荷或者不带电荷的氨基酸是与带负电荷的中肠膜结合过程中必不可少的，α5和α7是高度保守的，Nunez Valdez等人还实验证明其在离子通道形成中起关键作用，α5上突变H168R毒力稍有提高，但K+通透性比野生型降低了24倍，R173L、R173N则降低了2～3倍，毒力也降低，α7为富含螺旋结构的结构域Ⅰ上最后一个螺旋，它连接结构域Ⅰ和结构域Ⅱ，利用白喉毒素B片段替换CrylAcα7上疏水片段，发现与野生型相比，其对棉铃虫(H.armigera)一龄幼虫毒力提高8倍之多，LC50值为2.5 ng/cm，而野生型CrylAc则为20ng/cm，对棉铃虫三龄幼虫