恶臭假单胞菌海藻糖合酶基因在大肠杆菌中表达-expression of trehalose synthase gene in pseudomonas putida in escherichia coli.docxVIP

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2018-05-28 发布于上海
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恶臭假单胞菌海藻糖合酶基因在大肠杆菌中表达-expression of trehalose synthase gene in pseudomonas putida in escherichia coli

学位论文独创性声明本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。论文作者签名：日期：年月日学位论文知识产权权属声明本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为山东轻工业学院。论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日目录摘要 IABSTRACT I第 1 章绪论 11.1 海藻糖及其理化性质 11.1.1 海藻糖的发现及其化学结构 11.1.2 海藻糖的物理化学性质 21.2 海藻糖的生物学保护机理 31.2.1 “稳定态” 31.2.2 “优先排阻” 31.2.3 “玻璃态” 41.2.4 “水替代” 41.3 海藻糖的生物学功能 41.3.1 生物体的结构组分 41.3.2 贮存碳源和提供能量的物质 51.3.3 生物大分子的稳定剂和保护剂 51.4 海藻糖的检测 6薄层层析(TLC)7纸层析(PC)71.4.3 高效液相色谱(HPLC)71.4.4 蒽酮比色法 71.4.5 气相色谱(GC)71.4.6 酶法 81.5 海藻糖的生产方法 81.5.1 天然微生物抽提法 81.5.2 微生物发酵法 91.5.3 化学合成法制备海藻糖 91.5.4 海藻糖的酶法转化 91.5.5 基因工程法生产海藻糖 111.6 海藻糖的应用 121.6.1 在食品行业的应用 121.6.2 在医药行业的应用 141.6.3 在化妆品行业的应用 141.6.4 在农业方面的应用 141.7 本课题的立题背景和研究内容 151.7.1 立题背景 151.7.2 主要研究内容 15第 2 章 Pseudomonas putida P06 培养特性及分类鉴定172.1 引言 172.2 材料和方法 172.2.1 实验菌株 172.2.2 分子试剂 172.2.3 化学试剂 172.2.4 主要实验仪器 182.2.5 主要培养基 182.2.6 试剂的配制方法 192.3 实验方法 192.3.1 菌体形态特征观察 192.3.2 平板培养特征观察 202.3.3 运动性实验 202.3.4 基本生理生化实验 202.3.5 P06 生长曲线的测定202.3.6 细菌培养方法 202.3.7 粗酶液的制备方法 212.3.8 酶活力测定及海藻糖含量检测 212.3.9 超声破碎细胞 212.3.10 菌体量的测定 222.3.11 海藻糖的检测方法 22Pseudomonas putida P06 基因组 DNA 的提取 2416S rDNA 基因的 PCR 扩增与鉴定 252.4 结果与讨论 262.4.1 P06 细胞形态 262.4.2 P06 菌落形态 272.4.3 运动性实验 272.4.4 P06 菌株的生理生化实验结果 282.4.5 P06 的生长曲线测定 282.4.6 P06 的产酶实验结果 292.4.6 菌株 P06 的 16S rDNA 序列及进化树分析 312.5 本章小结 33第 3 章恶臭假单胞菌 P06 海藻糖合成酶基因的克隆与表达 353.1 引言 353.2 实验材料 353.2.1 菌株与质粒 353.2.2 引物合成 363.2.3 试剂盒与工具酶 363.2.4 生化试剂 363.2.4 主要仪器 373.2.5 培养基配制方法、培养条件及诱导条件 373.2.6 常用溶液的配方 383.3 实验方法 39Pseudomonas putida P06 基因组 DNA 的提取 39PCR 引物的设计 393.3.3 目的 DNA 片段的回收413.3.4 目的片段与载体的酶切 413.3.5 目的片段与 pET-15b 载体的链接423.3.6 E.coli BL21（DE3）感受态的制备423.3.7 转化大肠杆菌 BL21（DE3）423.3.8 小量质粒提取方法 433.3.9 重组克隆的验证 433.3.10 阳性克隆的诱导与蛋白的表达检验 453.4 实验结果分析 453.4.1 P06 Tres 基因的 PCR 扩增与载体的构建453.4.2 重组子的验证 483.4.3 P06 菌株 Tres 基因测序分析结果4