放射性碘原子标记hvegf-sirna的实验分析-experimental analysis of h vegf - sirna labeled with radioactive iodine atom.docxVIP

材料1细胞株和siRNA人肝癌细胞株HepG2细胞：由武汉市同济医院感染科实验室馈赠各种siRNA：上海吉玛制药技术有限公司所有引物：invitrogen公司2试剂DMEM培养基：丹麦Gibco公司磷酸盐缓冲液（PBS）：美国Sigma公司胰酶：美国Sigma公司Na131I：原子高科股份有限公司Bolton-Hunter试剂：美国ThermoScientific-Pierce氯胺-T：天津天成制药有限公司氯仿：上海强顺化学试剂有限公司异丙醇：上海国药集团化学试剂有限公司无水乙醇：天津市恒兴化学试剂制造有限公司Trizol试剂：美国invitrogen公司二甲基亚砜（DMSO）：美国Sigma公司苯：天津市富宇精细化工有限公司M-MLV逆转录试剂盒：美国Invitrogen公司二甲基甲酰胺（DMF）：上海国药集团化学试剂有限公司硼酸钠：武汉市中天化工有限责任公司碘化钠：天津市大茂化学试剂厂丙酮：天津市东丽区天大化学试剂厂乙酸铵：广东光华化学厂有限公司甲醇：重庆东方试剂厂Lipofectamin2000：美国invitrogen公司SYBRGreenmix：日本TOYOBO公司琼脂糖凝胶：北京三博远志生物技术有限责任公司Gelred染料：北京泛博生物化学有限公司10×TBE：武汉谷歌生物科技有限公司SDS凝胶制备试剂盒：武汉谷歌生物科技有限公司兔多克隆VEGFA、β-Actin抗体：武汉三鹰生物技术公司HRP标记的羊抗兔抗体：武汉三鹰生物技术公司X线片显影液、定影液：武汉谷歌生物科技有限公司ECL化学发光试剂：上海索莱宝生物科技有限公司胎牛血清：武汉天源生物技术公司3仪器材料NC膜：美国Millipore公司X线胶片：伊士曼柯达公司超滤离心管：美国MilliporeAmicon荧光显微镜：OLYMPUS公司CO2培养箱：美国Thero倒置显微镜：OLYMPUS公司低速离心机：湘仪离心机仪器有限公司高速冷冻离心机：德国Heraeus公司恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司超纯水发生器：美国MilloporeSimplicity电子天平：MettlerToledo公司高压灭菌锅：上海申安ZDX-35BI医用净化工作台：苏净集团苏州安全空气技术有限公司γ计数器/放射性层析扫描仪购：合肥众成机点技术发展有限公PCR扩增仪：美国BioRad公司凝胶成像系统：美国BioRad公司电泳仪：北京六一仪器厂分光光度计：Eppendorf公司Real-timePCR检测系统：上海宏石医疗科技有限公司（SLAN）方法第一部分设计合成有效的人VEGFsiRNA1设计并合成人VEGFsiRNA1.1在GenBank中查找人血管内皮生长因子（VEGF）mRNA序列（序列号：AB021221），利用Ambion公司的siRNAtargetfinder在线设计软件找到候选靶序列。1.2根据Reynolds等对siRNA设计规则的总结（表1），淘汰siRNA正义链6分以下的序列。表1Reynolds的siRNA设计规则规则说明得分是否1GC含量在30%-52%之间+1-12在第15-19个碱基之间还有3个以上A或者U每存在1个A或U+13没有内部反向重复序列（Tm值小于20°C）+14第19个碱基为A+15第3个碱基为A+16第10个碱基为U+17第19个碱基不是G或者C-18第13个碱基不是G-11.3在BLAST中将符合以上条件的序列与人基因组数据库进行对比，排除脱靶效应。1.4选取序列为：5’-GGAGUACCCUGAUGAGACCdTdT-3’（正义链)5’-GGUCUCAUCAGGGUACUCCdTdT-3’(反义链)的siRNA交由上海吉玛制药技术有限公司合成，并在正义链5’端标记FAM荧光。同时合成阴性对照siRNA：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTdTd-3’（正义链）5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’（反义链）。2验证人VEGFsiRNA的有效性2.1人肝癌细胞HepG2的培养(1)细胞复苏：按标签记载从液氮罐里取出HepG2细胞的冻存管，立即投入37°C到40°C的温水中，持续晃动使其尽快融化，将细胞冻存液转移至离心管里，然后加入5ml的培养液，吹打混匀。800rpm离心5min后，倾倒掉上清液，加入新鲜的DMEM完全培养液，轻轻吹打混匀后，将细胞悬浊液转移至培养瓶，并补足培养液。将培养瓶至于37°C、5%CO2培养箱内培养，24h后更换培养液。(2)细胞培养：HepG2细胞培养于含10%FBS的DMEM完全培养基中，在37°C、5%CO2培养箱内孵育3-4天，细胞融合度达70%-80%时，以1:3传代。若细胞传代超过20次，则重新复苏细胞。(3)细胞冻存：取处于对数生长期的HepG2细胞，用胰蛋白酶消化