酶蛋白质工程实验5从大豆中制备脲酶.pptVIP

主要内容 一、实验目的 二、基本原理 三、仪器试剂 四、实验步骤 五、结果计算 六、思考与讨论 第1页/共10页 一、实验目的 了解脲酶的制备过程。 掌握沉淀分离法分离纯化酶（蛋白质）的基本原理和技术方法。 了解测定和计算酶活力、酶比活力、回收率以及纯化倍数在酶分离纯化制备中的意义。 第2页/共10页 二、基本原理 脲酶的理化性质 脲酶（EC 3.5.6.5）相对分子质量为483,000，由6个亚基组成； 等电点4.9； 易溶于水和稀缓冲液中，粗酶较稳定，纯酶不太稳定，结晶酶在低温下可稳定1年以上； 该酶广泛存在于微生物与动、植物组织中，以大豆、刀豆中含量最为丰富； 本实验用乙醇或丙酮从大豆粉中提取脲酶，并用有机溶剂和等电点沉淀法纯化制备该酶。 第3页/共10页 三、仪器试剂 3.1 设备与耗材 大容量常速离心机、分光光度计、恒温水浴锅、移液器、摇床（或震荡器）。 容量瓶、烧杯、玻棒、量筒、试剂瓶、棕色塑料试剂瓶、移液管、双蒸水、吸耳球、洗瓶、比色皿、试管架、移液吸头（枪头）、eppendorf管、称量纸、精密pH试纸等； 第4页/共10页 3.2 试剂 大豆粉。 0.05 mol/L尿素底物溶液：3g尿素用磷酸盐缓冲液溶解并定容至100 mL。 1mol/L H2SO4溶液：5.6 mL浓硫酸，缓慢加入盛有约60mL蒸馏水中，冷却后加水定容至100mL。 标准硫酸铵溶液：精确称取在60℃干燥至恒重的分析纯硫酸铵2.643g蒸馏水溶解，定容至1000mL。此溶液含NH3为8μmol/mL。 纳氏试剂：在有碘化汞的情况下，可溶10g HgI2和7g KI于少量蒸馏水中，另溶16g NaOH于50mL水，待冷后，将前者慢慢倒入其中，边加边搅拌，最后用水稀释至100mL。过夜澄清后，倾出上清液存于棕色瓶中。 第5页/共10页 人造沸石。 磷酸盐缓冲液：6.70g Na2HPO4·2H2O、3.25g KH2PO4，溶于蒸馏水，调整pH至7.0，并定容至100 mL。 32%丙酮溶液：丙酮原液按体积百分比用蒸馏水配制。 2%醋酸溶液：冰醋酸2mL用蒸馏水稀释至100mL。 第6页/共10页 四、实验步骤 Step1：脲酶的提取 称取5g人造沸石，置小烧杯中，用2%醋酸浸泡两次，倾去酸，加蒸馏水反复洗涤至中性，沥干备用。 称取10g新鲜大豆粉，置于锥形瓶中，加上述人造浮石，加50mL 32%丙酮溶液，在冰浴中持续摇动4~5min，4层纱布过滤，收集滤液。 将滤渣重新倒入提取瓶中，另加10mL 32%丙酮，再提取一次。4层纱布过滤，滤液在3500 r/min条件下离心10min，小心倾出上清液，计量体积。取1 mL酶液保存，供测酶活力和蛋白质含量。 第7页/共10页 Step2： 脲酶的分离纯化（沉淀分离法） 脲酶在32%的丙酮中可以缓慢聚集而沉淀，但当酶液在等电点附近时，沉淀生成更快，故： 将提取的酶液置冰浴中，在缓慢搅拌下，用点滴管逐滴滴加2%醋酸，并不断用精密pH试纸检测pH变化，观察产生浑浊的现象，直至pH到达4.9左右，置4℃低温下过夜，析出沉淀。 将沉淀物仔细转入预冷的离心管，3500 r/min条件下离心10min，上清液回收丙酮；沉淀即为脲酶粗品。风干后，将所得粗酶溶于少量蒸馏水中（室温，计算体积），吸取0.2~0.4 mL用于测定酶活力和蛋白质含量。 第8页/共10页 五、结果计算与分析 第9页/共10页 六、思考与讨论 6.1 思考 沉淀分离法纯化酶（蛋白质）的基本原理是什么？如何进行？。 测定和计算酶活力、酶比活力、回收率以及纯化倍数在酶分离纯化制备中有何意义？ 6.2 讨论 关于实验过程的任何认识、体会、疑问和想法……。 第10页/共10页