感染红色荧光蛋白肝癌细胞的实验分析及双色荧光示踪肝癌原位移植瘤模型的建立-experimental analysis of liver cancer cells infected with red fluorescent protein and establishment of two-color fluorescence tracer liver cancer orthotopic transplantation tumor model.docxVIP

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2018-05-30 发布于上海
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感染红色荧光蛋白肝癌细胞的实验分析及双色荧光示踪肝癌原位移植瘤模型的建立-experimental analysis of liver cancer cells infected with red fluorescent protein and establishment of two-color fluorescence tracer liver cancer orthotopic transplantation tumor model.docx

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感染红色荧光蛋白肝癌细胞的实验分析及双色荧光示踪肝癌原位移植瘤模型的建立-experimental analysis of liver cancer cells infected with red fluorescent protein and establishment of two-color fluorescence tracer liver cancer orthotopic transplantation tumor model

感染红色荧光蛋白肝癌细胞的实验研究及双色荧光示踪肝癌原位移植瘤模型的建立中文摘要感染红色荧光蛋白肝癌细胞的实验研究及双色荧光示踪肝癌原位移植瘤模型的建立中文摘要第一部分感染红色荧光蛋白肝癌细胞的实验研究目的:通过慢病毒感染建立稳定高表达红色荧光蛋白（RFP）的人肝癌细胞HepG2/RFP和鼠肝癌细胞Hepa1-6/RFP，并探讨肝癌细胞感染前后的一些基本生物学和遗传学特性是否受到影响。方法：将同时载有红色荧光蛋白（RFP）基因及嘌呤霉素抗性基因的慢病毒感染人肝癌细胞HepG2及鼠肝癌细胞Hepa1-6，然后经嘌呤霉素筛选获得的细胞分别命名为HepG2/RFP、Hepa1-6/RFP。在荧光显微镜下观察感染后的细胞形态；HepG2/RFP、Hepa1-6/RFP细胞体外传代培养30代，通过流式细胞术（FACS）检测传代30代前后细胞感染RFP的阳性率；采用PCR检测肝癌细胞基因组中RFP基因的表达情况；通过CCK-8法、Transwell细胞侵袭实验、染色体分析实验，Western-blot实验比较感染前后肝癌细胞的增殖曲线、侵袭力、染色体核型及数目、相关蛋白AFP的表达水平等变化情况。结果:经嘌呤霉素筛选后，两肝癌细胞红色荧光蛋白的感染率都高达98％以上；PCR结果证实RFP基因成功整合至肝癌细胞中；肝癌细胞感染前后细胞的增殖曲线、侵袭力、染色体的核型及数目、相关蛋白AFP的相对表达量几乎没有改变。结论:本实验建立的人肝癌细胞HepG2/RFP及鼠肝癌细胞Hepa1-6/RFP既能稳定高表达RFP，又可以保持其原有的基本生物学及遗传学特性不变，为进一步进行肝癌追踪性研究及治疗提供了一个有用的新工具。关键词:红色荧光蛋白；肝癌细胞；慢病毒中文摘要感染红色荧光蛋白肝癌细胞的实验研究及双色荧光示踪肝癌原位移植瘤模型的建立第二部分双色荧光示踪肝癌原位移植瘤模型的建立目的:建立红、绿双色荧光示踪的肝癌原位移植瘤模型，并初步分析其基本特征。方法：将稳定高表达红色荧光蛋白的人肝癌细胞HepG2/RFP和鼠肝癌细胞Hepa1-6/RFP接种于全身表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的裸小鼠肝右叶，建立双色荧光示踪的肝癌原位移植瘤模型。采用活体荧光成像仪实时动态观察移植瘤的生长转移情况，然后取肝癌组织作连续冰冻切片，取肝癌原代组织培养，并在显微镜下观察移植瘤的组织结构特征。结果：成功建立了红、绿双色荧光示踪的肝癌原位移植瘤模型，建模成功率为100％。实时活体成像可检测到早期肿瘤的生长及转移，红色肿瘤团块随着移植时间的延长而增大、增多，并从肝区向肝外组织迁移。在荧光显微镜下观察移植瘤切片，不仅直观显示了重构的肝癌组织区域有大量的绿色宿主细胞和红色肿瘤细胞交织在一起，而且肝癌细胞的侵袭、迁移及肝癌细胞与宿主细胞的融合等也清晰可见，甚至可以精确到单个细胞水平。常规HE染色基本符合肝癌的基本特征。Hepa1-6/RFP肝癌原代组织的培养也证实了融合细胞参与了肝癌组织“重构体”的组成。结论:双色荧光示踪的肝癌原位移植瘤模型能够在活体内观察肿瘤的生长和转移，清晣显示肿瘤细胞与宿主细胞的位置和相互作用关系，为研究肿瘤细胞侵袭、转移和肿瘤微环境在肿瘤发生发展中的作用提供了－个新的可视化实验平台。与传统模型相比较，具有更高的实用价值。关键词:肝细胞癌；双色荧光示踪；原位移植模型；活体荧光成像系统；细胞融合作者：王小平指导教师：庄志祥基金资助项目：苏州市科技发展计划基金(No.SYS201129)感染红色荧光蛋白肝癌细胞的实验研究及双色荧光示踪肝癌原位移植瘤模型的建立英文摘要EstablishmentandresearchesofhepatomacarcinomacellswithexpressingRFPanddual-colorfluorescencetracingorthotopicmodelofhepatocellularcarcinomaAbstractPartITheexperimentalresearchesofhepatomacarcinomacellswithinfectedredfluorescentproteinObjective:Toestablishstablehighexpressingredfluorescentprotein(RFP)humanhepatomacellHepG2/RFPandmousehumanhepatomacellHepa1-6/RFP,whichinfectedredfluorescentproteinbylentivirus.Andtoexplorewhethersomebiologicalbasiccharacteristicsandgeneticcharacteristicsareinfluencedaft